$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
فئة
1. تحضير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) المؤهلة من ألواح مصفوفة الغشاء القاعدي المؤهلة
- قم بإذابة محلول مصفوفة الغشاء القاعدي المؤهل من hESC ببطء عند 4 درجات مئوية لمدة 2-3 ساعات على الأقل أو بين عشية وضحاها لتجنب تكوين مادة هلامية.
- لتحضير الألواح المطلية بالمصفوفة الغشائية القاعدية ، قم بتخفيف المصفوفة في وسط النسر المعدل البارد من Dulbecco باستخدام F12 (DMEM + F12) إلى تركيز نهائي بنسبة 2٪. تخلط جيدا وتغطي كل بئر من صفيحة 6 آبار ب 1 مل من محلول المصفوفة المخفف.
- احتضان الألواح المطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 3 ساعات على الأقل أو عند 4 درجات مئوية طوال الليل. < / >
ملاحظه: يمكن تخزين الألواح ذات المصفوفة الغشائية القاعدية عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد قبل إزالة محلول المصفوفة واستخدام الألواح.
2. تكيف hESCs من نوع المستعمرة مع ثقافة hESC أحادية الخلية
- لتمرير الثقافات الخالية من المغذيات من المستعمرة من النوع H9 (WA09) hESCs المزروعة على مصفوفة الغشاء القاعدي ، قم بشفط الوسط من الآبار (الشكل 1 أ).
- اغسل 1x مع 1 مل من DPBS. أضف 1 مل من محلول التباين (1 وحدة / مل) لكل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- قم بإزالة التباعد ، واغسل الخلايا 1x برفق مع 2 مل من DMEM / F12 ، وقم بإزالة الوسط ، وأضف 2 مل من DMEM / F12 إلى كل طبق.
- افصل المستعمرات برفق عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل ونقلها إلى أنبوب سعة 15 مل.
- الطرد المركزي الكريات لمدة 2 دقيقة عند 370 × جم وشفط الوسط.
- لتفكيك كريات الخلية إلى خلايا مفردة ، أضف 2 مل من محلول انفصال الخلية (تركيز 1x ، انظر جدول المواد) واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- خلايا الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 370 × جم وإزالة محلول الانفصال.
- أضف وسيط mTeSR1 البشري الطازج وفصل الخلايا إلى خلايا مفردة عن طريق سحب العينة اللطيف لأعلى ولأسفل.
- لتكييف hESCs من نوع المستعمرة مع مزرعة من نوع خلية واحدة ، قم بوضع ما يقرب من 1.5-2.0 × 106 hESCs في كل بئر من صفيحة 6 آبار مطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي في 2 مل من mTeSR1 تحتوي على مثبط 10 ميكرومتر ROCK لمدة 24 ساعة (الشكل 1 أ).
- بعد 24 ساعة ، استبدل وسط hESC ب mTeSR1 طازج بدون مثبط ROCK واسمح ل hESCs بالنمو كنوع أحادي الخلية لمدة 3 أيام. قم بتغيير الوسيط يوميا.
- في اليوم 4 ، عندما تصل الثقافات إلى ما يقرب من 100٪ من التقاء ، قم بفصل الخلايا في محلول الانفصال ، ثم أعد اللوحة كما هو موضح في الخطوة 2.6.
ملاحظه: يعمل مثبط ROCK على تحسين بقاء الخلية خلال ال 24 ساعة الأولى من ثقافة hESC من نوع خلية واحدة.
< p class = "jove_title" >
3. تمايز hESCs من نوع خلية واحدة إلى NPCs (الشكل 2)
- للحث على تمايز NPC ، قم بفصل hESCs من نوع خلية واحدة مع 1 مل من محلول الانفصال (1x) واحتضانه لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- الطرد المركزي للخلايا لمدة دقيقتين عند 370 × جم وإزالة محلول الانفصال الطافي. أضف 1 مل من DMEM/F12 وأعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينة اللطيف.
- خلايا صفيحة على صفيحة 6 آبار مغلفة بغشاء القاعدي بكثافة 2 × 105 خلايا / بئر في 2 مل من mTeSR1 تحتوي على مثبط 10 ميكرومتر من الصخور.
- بعد 24 ساعة ، استبدل وسط الاستزراع بوسط تحريض عصبي (DMEM مع 1٪ B27 ناقص فيتامين A) مكمل ب 1 ميكرومتر دورسومورفين و 5 ميكرومتر SB431542.
- قم بتغيير الوسيط كل يومين خلال أول 4 أيام من الحث العصبي ، ثم كل يوم حتى الوصول إلى التقاء في اليوم 7 (الشكل 2 ب).
ملاحظة: (1) يمنع دورسومورفين مسار BMP عن طريق استهداف مستقبلات ALK2،3،6 ويمنع أيضا AMPK. SB431542 هو مثبط لمسار TGFβ / Activin من خلال استهداف ALK5،7. (2) تم اختبار نفس البروتوكول باستخدام خط ESC آخر (WA01) ، والذي أسفر عن نتائج مماثلة ل WA09. (3) لقد استخدمنا بشكل عام Matrigel لمصفوفة الغشاء القاعدي ؛ ومع ذلك ، يمكن زراعة الخلايا على Geltrex ثم تمييزها إلى NPCs بنتائج متشابهة جدا كما يتضح من التعبير عن العديد من علامات NPC (الشكل 3D ، E). تعامل مع Geltrex بنفس طريقة Matrigel (انظر القسم 1).
