تحضير ثقافات الشرائح العائمة الحرة من دماغ بشري بالغ

الملخص

المصدر: Fernandes، A.، et al. مزارع الشرائح العائمة الحرة قصيرة المدى من الدماغ البشري البالغ. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو تقنية لإعداد مزارع شرائح عائمة بحرية من الدماغ البشري البالغ. يتم إنشاء شرائح رفيعة من قسم الدماغ باستخدام الاهتزاز. ثم يتم تعليق هذه الشرائح في وسط استزراع مكمل بعوامل النمو للحفاظ على صلاحية الأنسجة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< ص الفئة = "jove_title" >1. تعقيم المواد

ملاحظة: يجب تعقيم جميع المواد والمحاليل قبل الاستخدام.

1. تعقيم جميع الأدوات الجراحية ومواد التقطيع الاهتزازية (حامل السكين ، قرص العينة ، الصينية العازلة) في فرن تعقيم جاف لمدة 4 ساعات عند 180 درجة مئوية.
2. تعقيم المواد أو المعدات الحساسة لدرجة الحرارة عن طريق الأشعة فوق البنفسجية أو تشعيع جاما.
3. تعقيم الوسائط والمحاليل عن طريق التعقيم أو الترشيح من خلال أغشية المسام 0.22 ميكرومتر.

< p class = "jove_title" >2. إعداد الحلول

1. تحضير 15-20 مل من محلول النقل: 50٪ حجم / حجم محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) درجة الحموضة 7.4 ، 50٪ حجم / حجم متوسط قاعدي للحفاظ على الخلايا العصبية في الدماغ بعد الولادة والبالغين (جدول المواد) ، مكمل ب 10 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازي إيثان سلفونيك (HEPES) ، 3 مجم / مل جلوكوز ، و 33 ميكروغرام / مل جنتا><ميسين. ملاحظه: يجب تبريد محلول النقل وتزويده بالأكسجين (فقاعات بغاز الكربوجين) لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل جمع العينة.
2. قم بإعداد 300 مل من محلول التقطيع (HBSS مكمل ب 10 ملي مولار HEPES و 3 مجم / مل من الجلوكوز) وقم بتبريده في الفريزر إلى نقطة تكوين البلورات الأولي.
3. تحضير 20 مل من وسط الاستزراع: وسط قاعدي لصيانة الخلايا العصبية الدماغية بعد الولادة والبالغين (جدول المواد) مكمل بمشتق L-glutamine 1٪ (جدول المواد) ، مكمل 2٪ للزراعة العصبية (جدول المواد) ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، و 0.25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B.

< p class = "jove_title" >3. إعداد جهاز التقطيع

ملاحظة: يتم تنفيذ هذا البروتوكول بشكل مثالي بمساعدة زميل بسبب الخدمات اللوجستية لجمع العينات في غرفة الجراحة.

1. في دلو من الثلج المضاف إلى الملح ، اترك محلول التقطيع يرتاح تحت فقاعات خليط الكربوجين (95٪ O₂ ، 5٪ CO₂) لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
2. قم بإعداد كتلة من 3٪ agarose (حوالي 2 سم × 2 سم × 2 سم) وقم بلصقها على قرص عينة الاهتزاز من أجل إنشاء دعم ميكانيكي إضافي لعينة الأنسجة أثناء التقطيع (الشكل 1E).
3. اضبط الاهتزاز للتقطيع: سمك المقطع 200 ميكرومتر ، وتردد الاهتزاز 100 هرتز ، وسرعة التقطيع بين 0.5-1.0 مم / ثانية.
4. أغلق صينية الاهتزاز العازلة في قاعدة الاهتزاز وأضف الثلج لإبقائها مبردة قبل استلام محلول التقطيع والعينة ، وطوال عملية التقطيع.

< p class = "jove_title" >4. جمع العينات

ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم جمع الأنسجة القشرية الحديثة البشرية في غرفة الجراحة ونقلها إلى المختبر.

تنبيه: عند التعامل مع العينات البشرية ، اتبع بروتوكولات السلامة المناسبة التي وضعتها المؤسسة.

1. قم بإعداد جهاز النقل (الشكل 1 ج) الذي يتكون من: أسطوانة غاز محمولة بخليط كربوجين متصل بصمام ضغط / تدفق يتحكم في خرج الغاز المتصل بأنبوب سيليكون يربط خرج الغاز بوعاء النقل ؛ سفينة نقل ، عادة ما يكون أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 مل مع غطاء مثقب لإدخال الغاز ، تحتوي على محلول النقل ؛ والثلج لتبريد العينة أثناء النقل.
2. اجمع العينة وانقلها (الشكل 1 ب) على الفور إلى المختبر. اغمر العينة في محلول النقل البارد (فقاعات باستمرار بخليط الكربوجين).

5. التقطيع

1. انقل العينة إلى طبق بتري (100 مم × 20 مم) يحتوي على محلول تقطيع ، وباستخدام أدوات جراحية دقيقة ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السحايا المتبقية في العينة بعناية (الشكل 1 د).
2. اختر أفضل اتجاه للعينة لإنتاج شرائح ذات خصائص خاصة للتصميم التجريبي ، وباستخدام شفرة مشرط رقم 24 ، قم بقص سطح مستو ليكون القاعدة الملصقة على قرص العينة.
3. باستخدام ملعقة بلاستيكية يمكن التخلص منها وفرشاة رسم دقيقة ، اجمع الجزء من طبق بتري وجفف المحلول الزائد باستخدام ورق الترشيح (يجف عن طريق الشعيرات الدموية وتجنب لمس جزء الأنسجة بالورق).
4. باستخدام الغراء الفائق ، قم بتوصيل الأنسجة بقرص عينة الاهتزاز حتى يتم التصاقها بإحكام بالقرص وتلامس مع كتلة الاغاروز (الشكل 1 ه).
5. ضع قرص عينة الاهتزاز (مع تركيب الأنسجة بشكل صحيح) في صينية المخزن المؤقت الاهتزازية المملوءة بمحلول التقطيع الذي يجب أن يغلي أثناء العملية برمتها.
6. أغلق حامل السكين في مكانه مع تثبيت شفرة الحلاقة بإحكام.
7. يجب أن يغطي محلول التقطيع كلا من العينة والشفرة ، وعندها فقط يبدأ في التقطيع (الشكل 1F).
8. قطع العينة إلى شرائح 200 ميكرومتر.
   ملاحظه: على الرغم من أن بعض الاهتزازات تقطع العينات تلقائيا ، إلا أن المراقبة الدقيقة والتعديلات الطفيفة في سرعة التقطيع أثناء العملية قد تساعد في إنتاج شرائح أفضل. تجاهل الشرائح الأولية غير المنتظمة.
9. انقل الشرائح من الصينية العازلة إلى طبق بتري بمحلول التقطيع وقم بقص الحواف السائبة والأم البيضاء الزائدة إلى نسبة حوالي 70٪ قشرة / 30٪ مادة بيضاء.

< p class = "jove_title" >6. الثقافة

ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوة في خزانة تدفق رقائقي تحت بيئة معقمة.

1. أضف 600 ميكرولتر من وسط الاستزراع لكل بئر (في طبق 24 بئر) واحتضنه لمدة 20 دقيقة على الأقل عند 36 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} قبل طلاء الشرائح.
2. ضع شريحة واحدة لكل بئر باستخدام فرشاة رسم (الشكل 1 ز).
3. إذا كان هناك أي آبار غير مستخدمة في اللوحة ، فاملأها ب 400 ميكرولتر من الماء المعقم.
4. احتضان اللوحة عند 36 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   ملاحظه: يجب أن يتم الاستبدال المتوسط الأول في ما بين 8-16 ساعة بعد الطلاء اعتمادا على حجم الشريحة.
5. مكمل 10 مل من وسط الثقافة المعد مسبقا مع 50 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF).
   ملاحظه: خلال أول 8-16 ساعة ، يتم تحضين الشرائح في 600 ميكرولتر من الوسط لتجنب الحرمان من المغذيات والتحمض ، حيث يتم تسريع الاستهلاك المتوسط في هذه المرحلة. من الخطوة التالية ، يتم ضبط حجم الوسط لكل بئر إلى 400 ميكرولتر.
6. قم بإزالة 333 ميكرولتر من الوسط المكيف من كل بئر وأضف 133 ميكرولتر من الوسط الطازج المكممل ب BDNF.
7. كرر عملية الاستبدال المتوسط كل 24 ساعة عن طريق استبدال ثلث الوسط المكيف بوسط جديد مكمل BDNF.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: جمع العينات ونقلها وتقطيعها واستزراعها من البشر البالغين. يبدأ الإجراء في غرفة الجراحة بجمع الأنسجة القشرية من استئصال الفص الصدغي لعلاج الصرع المقاوم للأدوية (أ ، ب). (ج) يتم نقل جزء الأنسجة (ن = 1) على الفور إلى أنبوب يحتوي على وسيط نقل مؤكسج مثلج بارد (انظر أدناه). (د) في المختبر ، تتم إزالة السحايا باستخدام ملاقط العين الدقيقة. يتم تجفيف السائل الزائد باستخدام ورق الترشيح ، وي...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أغاروز سيجما ألدريتش أ 9539 بيرسلفات الأمونيوم سيغما أ 3678-25 جي الأمفوتريسين ب جيبكو 15290-018 ب 27 جيبكو 17504-044 BDNF سيجما ألدريتش SRP3014 ألبومين مصل الأبقار سيجما ألدريتش أ 7906 الجلوكوز ميرك 108337 جلوتاماكس جيبكو 35050-061 أملاح هانك المتوازنة سيجما ألدريتش H1387-10X1L هيبس سيجما ألدريتش إتش 4034 العصبي أ جيبكو 10888-022 PBS الرقم الهيدروجيني المخزن المؤقت 7.2 لابروبلين 590338 البنيسلين / الستربتوميسين سيجما ألدريتش ص 4333 المعدات والمواد خليط الكربوجين وايت مارتينز 95٪ O2 ، 5٪ CO2 حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ نيو برونزويك العلمي CO-24 حضانة شرائح 5٪ CO2 ، 36 درجة مئوية ملعقة بلاستيكية حجم ملعقة الحلوى شفرة الحلاقة بيك كروم بلاتينيوم ، يستخدم في التقطيع مع الاهتزاز شفرة مشرط بيكتون ديكنسون (دينار بحريني) رقم 24 تستخدم لتقطيع الأنسجة ؛ موصى بها بنفس الحجم أو أصغر Superglue (Loctite Super Bonder) هنكل التركيب: Etilcianoacrilato ؛ 2-حمض البروبينويك ؛ 6،6'-di-terc-butil-2،2'-metilenodi-p-cresol ؛ homopolymer الاهتزاز لايكا 14047235612 - VT1000S