عزل واستزراع الخلايا الدبقية الصغيرة من أدمغة الفئران باستخدام وسائط خالية من المصل

الملخص

المصدر: Collins ، H. Y. ، et al. ، عزل واستزراع الخلايا الدبقية الصغيرة القوارض لتعزيز مورفولوجيا ديناميكية متشعبة في وسط خال من المصل. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو طريقة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة واستزراعها من أدمغة الفئران. يستلزم فصل الخلايا الدبقية الصغيرة عن الخلايا العصبية وغير العصبية الأخرى باستخدام ألواح مغلفة بجسم مضاد أحادي النسيلة خاص بالخلايا الدبقية الصغيرة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. قم بإعداد طبق بتري ل CD11b Immunopanning (اليوم 0)

< p class = "jove_content" >ملاحظة: قم بإعداد طبق مناعي واحد لكل 1-2 أدمغة فئران صغيرة.

1. أضف 25 مل من محلول 50 ملي من محلول Tris pH 9.5 إلى طبق بتري مقاس 15 سم.
2. أضف الماعز المضاد للفأر IgG (سلاسل H + L) إلى الطبق للحصول على تركيز نهائي يبلغ 6 ميكروغرام / مل. لوحة دوامة لتوزيعها بالتساوي.
3. احتضن الطبق لمدة 1-3 ساعات عند 37 درجة مئوية.
4. اشطف الأطباق ثلاث مرات باستخدام DPBS ++ (محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع Ca²⁺ و Mg²⁺) ، ثم استبدلها بمحلول عازل يحتوي على 1 ميكروغرام / مل من الجسم المضاد OX42. اترك الأطباق طوال الليل في درجة حرارة الغرفة على سطح مستو.

< p class = "jove_title" >2. جمع الأنسجة (اليوم 1)

ملاحظة: يجب أن يستغرق هذا البروتوكول ~ 3 - 4 ساعات.

1. قبل البدء ، تأكد من أن جميع المحاليل معقمة ومبردة على الثلج. قم بتبريد جميع الأدوات على الثلج وتعقيمها بالإيثانول قبل الاستخدام.
2. باتباع الإجراءات التنظيمية المناسبة ، قم بالتضحية بفأر المختبر الصغير عن طريق الاختناق بثاني أكسيد الكربون.
   ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن التضحية بالحيوانات الأصغر سنا بجرعة مميتة من الكيتامين / الزيلازين (100 - 200 ميكرولتر من 24 مجم / مل كيتامين ، 2.4 مجم / مل زيليازين). يجب استخدام الكيتامين / الزيلازين إذا كان عمر أقل من 14 يوما. إذا كنت تستخدم متعددة ، فقم باستخراج الأنسجة من واحد وضعها في DPBS ⁺⁺ المبردة مسبقا على الجليد قبل الانتقال إلى اللاحقة.
3. اضغط على مخلب الظهر وتأكد من عدم الاستجابة الكاملة للحيوان قبل المتابعة.
4. قم بنقف عبر القلب ب 10 - 30 مل من محلول التروية المثلج باستخدام إبرة 27 / 2 جم حتى يصبح المخزن المؤقت واضحا.
   ملاحظه: يختلف حجم المخزن المؤقت للتروية حسب حجم / عمر.
5. مباشرة بعد التروية إزالة رأس. عند الخروج من الحبل الشوكي ، قم بقطع اللقمة القذالية على كل جانب بمقص تشريح ، احرص على عدم إتلاف الدماغ. بعد قطع كل جانب بعناية ، قم بقص جانب واحد على طول العظم الجداري والأمامي باتجاه عظم الأنف. باستخدام الملقط ، اسحب الجزء العلوي من الجمجمة بعناية ، وقم بإزالة الدماغ بسرعة (أو هياكل الجهاز العصبي المركزي ذات الأهمية) ، وضعها في DPBS ⁺⁺ المبردة مسبقا على الجليد.
6. كرر مع جميع المتبقية.
   ملاحظه: يجب تنفيذ جميع خطوات الإجراء في غطاء التدفق الصفحي في ظل ظروف معقمة مناسبة.

< p class = "jove_title" >3. التفكك الميكانيكي (اليوم 1)

1. بعد جمع جميع الأدمغة ، قم بتقطيع دماغ واحد إلى قطع 1 مم³ في طبق بتري على الثلج بشفرة مشرط بارد ، ثم انقله إلى الخالط المثلج البارد مع 5-7 مل من محلول النزوح المثلج. فصل دماغ واحد في كل مرة.
2. قم بفصل الأنسجة باستخدام 10-20 ضربة لطيفة وغير مكتملة باستخدام الخالط الفضفاض. احرص على عدم سحق الأنسجة الموجودة في الجزء السفلي من الخالط مباشرة ، ولكن بدلا من ذلك ادفع الأنسجة عبر الفراغ بين جانبي المكبس والمجانس.
3. قم بإزالة المكبس بعناية لمنع دخول فقاعات الهواء. اسمح لقطع الأنسجة المنفصلة بشكل سيئ بالاستقرار في قاع الخالط ، وانقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي جديد مبرد سعة 50 مل.
4. استبدل الحجم الذي تمت إزالته بمخزن مؤقت جديد ، وكرر الخطوتين 3.2 و 3.3 ليصبح المجموع من 3 إلى 4 جولات ، أو حتى يتم فصل جميع الأنسجة. كرر الإجراء لكل دماغ.

< p class = "jove_title" >4. إزالة المايلين (اليوم 1)

ملاحظة: تستخدم إزالة المايلين لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة عن التي يزيد عمرها عن P12.

1. قم بقياس حجم تعليق الخلية في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل باستخدام ماصة سعة 25 مل، ثم أضف المخزن المؤقت البارد لضبط الحجم الإجمالي إلى 33.5 مل.
2. أضف 10 مل من المخزن المؤقت لفصل المايلين (MSB) إلى تعليق الخلية واخلطه جيدا عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. سيؤدي ذلك إلى تركيز نهائي بنسبة 23٪ من MSB بحجم 43.5 مل.
3. خلايا الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية مع الكبح البطيء.
   ملاحظه: يجب أن يستغرق جهاز الطرد المركزي حوالي 1.5 - 2 دقيقة حتى يتباطأ. سيؤدي ذلك إلى توليد طبقة علوية من المايلين وحطام الخلايا الميتة ، ومادة طافية غامضة إلى حد ما ، وحبيبات أصغر يتم إثرائها للخلايا الحية.
4. قم بإزالة الطبقة العليا من المايلين / الحطام والطافي باستخدام ماصة. توخ الحذر عند إزالة الطبقة العليا لضمان إزالة أكبر قدر ممكن منها.
5. أعد تعليق حبيبات الخلية في 12 مل من المخزن المؤقت للتحريك. قم بتقطيع معلق الخلية برفق لتفتيت أي كتل من الخلايا قد تبقى.

< ص الفئة = "jove_title" >5. المناعة (اليوم 1)

1. مرر معلق الخلية عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر لإزالة الحطام الكبير أو كتل الخلايا.
2. اشطف طبق المقلاة المطلي ب OX42 ثلاث مرات باستخدام DPBS ++. لا تدع الطبق يجف تماما بين الغسل.
3. اسكب آخر غسول DPBS ++ وقم بتطبيق تعليق الخلية المصفى على طبق التحريك. قم بتدوير اللوحة برفق لتوزيع الخلايا ، ثم احتضن اللوحة على سطح مستو في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة للسماح للخلايا بالالتصاق. لا تحتضن لمدة تزيد عن 20 دقيقة وإلا سيصبح من الصعب جدا استعادة الخلايا من الطبق.
4. اشطف طبق المقلاة باستخدام DPBS ++ 10 مرات لإزالة الخلايا غير الملتصقة. سيتم ربط الخلايا الدبقية الصغيرة بإحكام باللوحة ، لذا قم بتدوير اللوحة مع كل شطف لضمان إزالة الخلايا الأخرى غير الملتصقة.
5. اسكب آخر غسول DPBS ⁺⁺ واستبدله ب 15 مل DPBS ++ و 200 ميكرولتر من التربسين (محلول مخزون 1.25٪).
6. احتضن الطبق لمدة ≤10 دقائق عند 37 درجة مئوية مع 10٪ ثاني أكسيد الكربون₂ للتربسين.
   ملاحظه: لا تستمر لمدة تزيد عن 10 دقائق وإلا سيصبح من الصعب إزالتها الصغيرة.
7. بعد 10 دقائق من التربسينية ، ستظل الخلايا الدبقية الصغيرة عالقة في الطبق. اسكب التربسين / DPBS ⁺⁺ واغسله برفق 2x باستخدام DPBS ⁺⁺ لإزالة التربسين ، واستبدله ب 12 مل من وسط نمو الخلايا الدبقية الصغيرة المثلجة (MGM).
8. ضع طبق المقلاة على الثلج لمدة دقيقتين للمساعدة في إضعاف تفاعل الخلية / الركيزة ، وتأكد من أن الطبق مسطح لمنع مناطق طبق المقلاة من الجفاف.
9. ماصة بقوة مع ماصة سعة 10 مل ووحدة تحكم في الماصة بسرعة عالية لاستعادة الخلايا من طبق التحريك. ارسم شبكة مقاس 16 × 16 مع تيار السائل من الماصة لمحاولة إزالة جميع الخلايا.
10. افحص الخلايا تحت المجهر بتكبير 20 ضعفا للتأكد من انفصال الخلايا عن اللوحة. ضع علامة على البقع الموجودة أعلى الطبق حيث لا تزال الخلايا عالقة ، وكرر سحب العينات في تلك المناطق.
11. اجمع تعليق الخلية وكمية 3-4 مل من المادة الطافية لكل أنبوب مخروطي سعة 15 مل. تدور لمدة 15 دقيقة عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية مع الكبح البطيء.
    ملاحظه: يسمح الغزل الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال حجم صغير بأقصى قدر من التعافي للخلايا.
12. استنشق المادة الطافية ، وترك 0.5 مل من MGM مع حبيبات الخلية.
13. أعد تعليق كل حبيبات في MGM المتبقية, وتجميع الخلايا من جميع الأنابيب.
14. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
15. خلايا اللوحة كما هو موضح في الخطوات 6 - 7 حسب التطبيق.
16. خلايا الزراعة عند 37 درجة مئوية مع 10٪ CO₂.
    ملاحظه: يمكن زراعة الخلايا لمدة تصل إلى 3-4 أسابيع مع تغييرات منتظمة في الوسائط أو أسبوع واحد بدون تغييرات في الوسائط.

فئة < p = "jove_title" >6. ألواح زراعة الأنسجة الموضعية / أغطية (اليوم 1)

1. لوحة 15 ميكرولتر من طلاء الكولاجين الرابع مباشرة في وسط لوحة زراعة الأنسجة الأنيونية / الموجبة المطلية ب 24 بئرا (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 10٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. بعد عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، قم بتخفيف الخلايا إلى 2.3 × 10⁵ / مل في MGM. شفط بقعة الكولاجين IV ولوحة على الفور 15 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى هذه البقعة; سيعطي هذا 3.5 × 10³ خلايا / بقعة. احتضن لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية مع 10٪ ثاني أكسيد الكربون₂ للسماح للخلايا بالالتصاق ، أضف 500 ميكرولتر من ثاني أكسيد الكربون 2 موازنة TGF-β2 / IL-34 / الكوليسترول المحتوي على وسط نمو (TIC) برفق إلى البئر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات المخزن المؤقت الوصفة: 200 ميكرولتر من 0.4٪ DNaseI في 50 مل من DPBS ++
تعليقات: استخدميه عندما يكون باردا المخزن المؤقت للتحريك الوصفة: 2 مجم / مل من البيبتون من مواد الحليب الصلبة في DPBS ++ وسط نمو الخلايا الدبقية الصغيرة (MGM) الوصفة: DMEM / F12 يحتوي على 100 وحدة / مل بنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، 2 ملي جلوتامين ، 5 ميكروغرام / مل N-acetyl سيستين ، 5 ميكروغرام / مل أنسولين ، 100 ميكروغرام / مل apo-transferrin ، و 100 نانوغرام / مل سيلينيت الصوديوم
تعليقات: استخدم MGM المثلج لتقليب الخلايا الدبقية الصغيرة من طبق immnopanning. طلاء الكولاجين الرابع الوصفة: MGM تحتوي على 2 ميكروغرام / مل كولاجين IV عازلة فصل المايلين الوصفة: 9 مل بيركول بلس ، 1 مل 10x PBS بدون Ca ++ و Mg ++ ، 9 ميكرولتر 1 م CaCl2 ، 5 ميكرولتر 1 م MgCl2
التعليقات: تخلط جيدا بعد إضافة CaCl2 و MgCl2 التربسين سيغما تي 9935 DMEM / F12 جيبكو 21041-02 البنسلين / الستربتومايسين جيبكو 15140-122 DMEM (ارتفاع الجلوكوز) جيبكو 11960-044 الكولاجين الرابع إعادة التكوين: 200 ميكروغرام / مل في PBS
التركيز المستخدم: 1: 100 < / > التخزين: -80 درجة مئوية فأر مضاد للفئران CD11b أحادي النسيلة (استنساخ OX42) بيو راد MCA275R التحريك: 1: 1,000 ؛ تلطيخ: 1:500 TGF-b2 / IL-34 / الكوليسترول المحتوي على وسائط النمو (TIC) الوصفة: MGM يحتوي على 2 نانوغرام / مل TGF-b2 ، 100 نانوغرام / مل من الفئران IL-34 ، 1.5 ميكروغرام / مل من كوليسترول صوف الأغنام ، 10 ميكروغرام / مل من كبريتات الهيباران ، 0.1 ميكروغرام / مل حمض الأوليك ، و 0.001 ميكروغرام / مل حمض الجندويك
التعليقات: تأكد من إضافة الكوليسترول إلى الوسائط الدافئة إلى 37 درجة مئوية ولا تضيف أكثر من 1.5 ميكروغرام / مل وإلا فسوف يترسب. لا تقم بتصفية الوسائط المحتوية على الكوليسترول. قم بموازنة وسائط TIC مع 10٪ CO2 لمدة 30 دقيقة - 1 ساعة قبل إضافتها إلى الخلايا لضمان درجة الحموضة المثلى. بيركول بلس جنرال إلكتريك للرعاية الصحية قطة # 17-5445-02 لوحات بريماريا VWR قطة # 62406-456 DNaseI ورثينجتون القط # DPRFS