مقالة منهجية

تحضير أقسام الدماغ باستخدام طريقة التعافي الوقائية القائمة على NMDG

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Ting، J. T. et al. تحضير شرائح الدماغ الحادة باستخدام طريقة استعادة وقائية محسنة من N-Methyl-D-glucamine. J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو بروتوكولا للحصول على شرائح الدماغ باستخدام طريقة الاسترداد الوقائية القائمة على N-Methyl-D-glucamine (NMDG). يتم تحضين الدماغ المقطوع في aCSF مع NMDG و HEPES لتقليل موت الخلايا العصبية وتلفها أثناء التقسيم. يسمح للقسم بالتعافي في aCSF لاستعادة الأنشطة الخلوية

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تشريح الدماغ والتقطيع

  1. قطع رأس. استخدم مشرطا لفتح الجلد على الرأس وفضح غطاء الجمجمة.
  2. استخدم مقصا فائق القطع لقطع الجلد فوق غطاء الجمجمة وعمل شقوق صغيرة بشكل جانبي على كلا الجانبين عند القاعدة الذيلية / البطنية للجمجمة. قم بعمل جروح ضحلة إضافية بدءا من الجانب الذيلي / الظهري للجمجمة ، وتحرك في الاتجاه المنقاري أعلى خط الوسط الظهري مع الحرص على عدم إتلاف الدماغ الأساسي. قم بعمل قطع نهائي "T" عموديا على خط الوسط على مستوى المصابيح الشمية.
    ملاحظه: يجب توخي الحذر لضمان عدم حدوث ضرر لمنطقة (مناطق) الدماغ ذات الاهتمام. على وجه الخصوص ، لا ينبغي أن يكون هناك أي قوة ضغط تطبق على الدماغ نفسه.
  3. استخدم ملقط الرأس المستدير لإمساك الجمجمة ، بدءا من الجانب المندرج الإنسي وقشر مرة أخرى باتجاه الاتجاه الذيلي-الجانبي. كرر ذلك لكلا الجانبين لفتح وإزالة النصفين الظهريين لغطاء الجمجمة لكشف الدماغ. استخرج الدماغ السليم برفق في دورق NMDG-HEPES aCSF المبرد مسبقا. اسمح للدماغ بالتبريد بشكل موحد لمدة ~ 1 دقيقة.
  4. استخدم الملعقة الكبيرة لرفع الدماغ من الدورق إلى طبق بتري المغطى بورق الترشيح. قم بقص الدماغ وحظره وفقا لزاوية التقطيع المفضلة ومنطقة الدماغ المطلوبة ذات الاهتمام. اعمل بسرعة لتجنب الحرمان من الأكسجين لفترات طويلة أثناء المناولة.
    ملاحظه: العديد من زوايا التقطيع ممكنة. تعتمد طريقة الحجب الدقيقة وزاوية التقطيع على منطقة الدماغ الدقيقة ونوع الخلية والدائرة المراد دراستها.
  5. قم بلصق كتلة الدماغ على حامل العينة باستخدام الغراء اللاصق. اسحب القطعة الداخلية لحامل العينة بما يكفي لسحب كتلة الدماغ بالكامل من الداخل. صب الاغاروز المنصهر مباشرة في الحامل حتى يتم تغطية كتلة الدماغ بالكامل باللاغاروز. قم بتثبيت كتلة التبريد الملحقة المبردة مسبقا حول حامل العينة لمدة ~ 10 ثوان حتى يتجمد الاغاروز.
  6. أدخل حامل العينة في الوعاء الموجود على آلة التقطيع وتحقق من المحاذاة المناسبة. املأ الخزان بما تبقى من NMDG-HEPES aCSF المبرد مسبقا والأكسجين من دورق 250 مل وانقل حجر الفقاعات إلى الخزان طوال مدة التقطيع لضمان الأكسجين الكافي.
  7. اضبط الميكرومتر لبدء تقدم عينة الدماغ المضمنة في الاغاروز. ابدأ تشغيل القطاعة واضبط تجريبيا سرعة التقدم وتردد التذبذب إلى المستوى المطلوب.
    ملاحظه: يجب أن يكون كلا الإعدادين في النطاق المنخفض. للحصول على أفضل النتائج ، يجب أن تستغرق تمريرة واحدة لذراع الشفرة حوالي 20 ثانية ويجب أن ينتج عن التذبذب ضوضاء طنين سلسة ولطيفة للغاية بدون طنين علني.
  8. استمر في التقدم وتقطيع الأنسجة بزيادات قدرها 300 ميكرومتر (أو أي سمك مفضل آخر) حتى يتم تقسيم منطقة الدماغ محل الاهتمام بالكامل ؛ يجب أن يكون الوقت الإجمالي لإجراء التقطيع أقل من 15 دقيقة.
< p class = "jove_title" >2. إجراء الاسترداد الوقائي NMDG الأمثل

  1. خطوة الاسترداد الأولية ل NMDG (الخطوة الحرجة): عند الانتهاء من إجراء التقسيم، اجمع جميع الشرائح باستخدام ماصة باستور بلاستيكية مقطوعة ونقلها إلى غرفة استرداد أولية مدفأة مسبقا (34 درجة مئوية) مملوءة ب 150 مل من NMDG-HEPES aCSF. انقل جميع الشرائح في تتابع قصير وابدأ مؤقتا بمجرد نقل جميع الشرائح إلى غرفة الاسترداد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ضغط VF-200 الأدوات الدقيقة في إف -200 قطاعة الأنسجة الاهتزازية (موصى به) ن-ميثيل-د-جلوكامين سيجما ألدريتش M2004 مكون aCSF كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش S3014 مكون aCSF كلوريد البوتاسيوم سيجما ألدريتش ص 5405 مكون aCSF فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة ثنائي الهيدرات سيجما ألدريتش 71505 مكون aCSF بيكربونات الصوديوم سيجما ألدريتش الطراز S5761 مكون aCSF هيبس سيجما ألدريتش إتش 4034 مكون aCSF الجلوكوز سيجما ألدريتش جي 7021 مكون aCSF أسكوربات الصوديوم سيجما ألدريتش أ 4034 مكون aCSF ثيوريا سيجما ألدريتش تي 8656 مكون aCSF بيروفات الصوديوم سيجما ألدريتش ص 5280 مكون aCSF ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم سيجما ألدريتش [ك7902] مكون aCSF كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدرات سيجما ألدريتش M1880 مكون aCSF ملقط حاد منحني أدوات العلوم الدقيقة 11065-07 أدوات تشريح الدماغ مقص تشريح دقيق (supercut) أدوات العلوم الدقيقة 14058-09 أدوات تشريح الدماغ مقص كبير شديد التحمل 7 بوصة أدوات العلوم الدقيقة 14000-18 أدوات تشريح الدماغ ملعقة معدنية سيجما ألدريتش Z511455-1باك أدوات تشريح الدماغ شفرات الحلاقه VWR 89031-954 أدوات تشريح الدماغ حافظ شرائح الدماغ -4 أتمتة العلمية إس بي إس كي4 غرفة عقد شريحة الدماغ النايلون المعاوضة وارنر إنسترومنتس 64-0198 لبناء غرف استرداد شرائح صغيرة أكواب زجاجية من بيركس (250 مل) VWR 89090-434 لبناء غرف استرداد شرائح صغيرة طبق بلاستيكي 35 مم دائري VWR هاتف: 100488-376 لبناء غرف استرداد شرائح صغيرة أحجار ناشر الغاز (10 ميكرومتر) سيجما ألدريتش 59277 للكربوجين المستمر (الفقاعات الدقيقة) نوع الاغاروز I-B سيجما ألدريتش أ 0576 لتضمين عينات الدماغ حمض الهيدروكلوريك سيجما ألدريتش H1758-100 مل لتعديل درجة الحموضة للوسائط هيدروكسيد الصوديوم سيجما ألدريتش 221465-25 جرام لتعديل درجة الحموضة للوسائط هيدروكسيد البوتاسيوم سيجما ألدريتش 221473 لتعديل درجة الحموضة للوسائط ماصات نقل البلاستيك 3 مل متدرجة VWR 89497-676 لنقل الشرائح شفرات حاقن سيراميك الزركونيوم شفرات الإيقاع المتخصصة إف - إنز 10 http://cadenceinc.com/ حمام مائي ساخن (2.5 لتر) VWR هاتف: 13491-060 متنوعه جولات ورق الترشيح VWR هاتف: 28456-022 متنوعه الغراء سيانواكريليت الامازون B000BQRBO6 متنوعه طبق بتري زجاجي VWR 89000-326 متنوعه 10X محلول ملحي مخزن بالفوسفات سيجما ألدريتش ص 5493 متنوعه خلاط حراري (مع كتلة أنبوب 1.5 مل) VWR 89232-908 للحفاظ على الاغاروز منصهرة

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NMDG HEPES aCSFBrain SectioningAcute Brain SlicesProtective Recovery MethodArtificial Cerebrospinal FluidAgarose EmbeddingVibratome SlicingSlice Recovery ChamberNeuronal Cell ViabilityElectrophysiological Properties

مقالات ذات صلة