$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.
فئة
1. تحضير الشبكية الكاملة وإزالة الغشاء المحدد الداخلي
- قم بإعداد حوامل الشبكية بالكامل إما في ظل ظروف الإضاءة المختبرية العادية أو الضوء الأحمر / الأشعة تحت الحمراء الخافتة.
- القتل الرحيم للحيوان عن طريق خلع عنق الرحم واستئصال العينين على الفور. قم بعمل قطع صغير على طول أورا سيراتا ، وضعه إما في وسائط أميس ، أو السائل النخاعي الاصطناعي (aCSF) الذي يحتوي على (مللي مولار): 125 كلوريد الصوديوم ، 25 NaHCO3 ، 3 كيلو كلوريد ، 2 كلوريدالكالسيوم 2 ، 1 ملغ كلوريد2 ، 10 جلوكوز ، 0.5 لتر جلوتامين ، وتشبع بالكربوجين (95٪ O2/5٪ خليط ثاني أكسيد الكربون2 ؛ ~ 300 مللي أسم ؛ درجة الحموضة 7.4) ، في درجة حرارة الغرفة (RT).
- قم بإزالة القرنية والعدسة والجسم الزجاجي على الفور عن طريق قطع أورا سيراتا بمقص صغير وإزالة العدسة والجسم الزجاجي بالملقط. ضع الأنسجة في نظام الحضانة في RT.
ملاحظه: يمكن الحفاظ على أنسجة الشبكية في كوب العين ، بعد انخفاض درجة الحرارة البطيئة إلى 15 - 16 درجة مئوية ، لمدة >24 ساعة في نظام الحضانة لحين الحاجة.
- لإزالة ILM ، انقل واقية العين التي تحتوي على شبكية العين إلى وعاء زجاجي صغير يحتوي على 30 U / مل من غراء ، و 1 ملي مولار L-cystine ، و 0.5 ملي مولار من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) و 0.005٪ ديوكسيربونوكلياز (DNase) في محلول الملح المتوازن من إيرل (BSS) عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. في حالة استخدام أنسجة من الصغيرة (<6 أسابيع) ، قم بتخفيف المحلول إلى نصف القوة.
- أوقف الهضم الأنزيمي عن طريق وضع الأنسجة في محلول بويضي (10 مجم / مل) ومحلول ألبومين مصل بقري (BSA ، 10 مجم / مل) لمدة 10 دقائق في Earl's BSS. اغسل الأنسجة جيدا باستخدام aCSF قبل نقلها إلى نظام الحضانة وخفض درجة الحرارة إلى 15-16 درجة مئوية.
- حافظ على أنسجة الشبكية في منظار العين لحين الحاجة. لنقلها إلى المجهر ، اعزل شبكية العين عن واقية العين وقطعها إلى 4 قطع باستخدام شفرة حلاقة. إذا كانت شبكية العين بأكملها مطلوبة ، فقم بعمل أربع جروح صغيرة في محيط شبكية العين للسماح لها بالاستلقاء بشكل مسطح.
ملاحظه: لتجارب التصوير ، قم بتحميل أصباغ الكالسيوم قبل نقلها إلى نظام الحضانة ، انظر أدناه.
< p class = "jove_title" >
2. الحفاظ على الأنسجة في الحاضنة
- ضع الأنسجة في الغرفة الرئيسية التي تحتوي على مجسات لقياسات الأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة (الشكل 1 أ ، ب).
- قم بتعميم aCSF من خلال غرفة ثانية (غرفة UVC ، مبنية كما هو موضح سابقا) معزولة من الغرفة الرئيسية وتعرضها لضوء الأشعة فوق البنفسجية C (UVC) 1.1 واط (254 نانومتر ، مصباح الأشعة فوق البنفسجية المعقم 5W / 2P) من أجل القضاء على البكتيريا العائمة في المحلول (الشكل 1 أ). تحكم في توقيت ضوء الأشعة فوق البنفسجية عبر مؤقت قابل للبرمجة باستخدام ميزة عشوائية يتم تشغيلها في بعض الأحيان تتراوح بين 15 و 26 دقيقة كل 15 - 30 دقيقة لتجنب التسخين المفرط ل aCSF.
- اضبط معدل التدفق في غرفة الأشعة فوق البنفسجية على 12 مل / دقيقة كما هو مذكور سابقا. قم بتغطية غرفة الأشعة فوق البنفسجية بورق الألمنيوم لمنع إضاءة الأشعة فوق البنفسجية خارج الغرفة ، والتي يمكن أن تلحق الضرر بالأنسجة العصبية.
ملاحظه: بالنسبة لأنسجة الشبكية المتكيفة مع الظلام ، ضع غطاءا مخصصا على الغرفة الرئيسية لاستبعاد الضوء.
- استخدم مضخة تمعجية لتدوير المحلول (aCSF) عبر الغرفتين ومبرد الألواح الباردة الكهروحرارية Peltier إما لتبريد أو تسخين الغرفة الرئيسية إلى درجات الحرارة المطلوبة في حدود 0 - 50 درجة مئوية. للحصول على حضانة الأنسجة المثلى ، استخدم 15-16 درجة مئوية للبقاء على المدى الطويل.
