عزل واستزراع الخلايا الجذعية العصبية البالغة من منطقة الفأر تحت الثفني

الملخص

المصدر: Kim, J. Y., et al. عزل واستزراع الخلايا الجذعية العصبية البالغة من المنطقة تحت الكالوسالية للفأر. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح الفيديو عملية عزل الخلايا الجذعية العصبية وزراعتها من المنطقة تحت الثففية لدماغ الفأر. يتضمن تشريح الأنسجة والتفكك الأنزيمي وزراعتها بعوامل التمايز لتتطور إلى خلايا عصبية ناضجة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير المواد ووسط الثقافة

1. لتشريح وتفكك SCZ (المنطقة تحت الكالوسالية) ، لف مصفوفة الدماغ ، وشفرة الحلاقة ذات الحدين ، والملقط بورق الألمنيوم ، ثم قم بتعقيمها عن طريق التعقيم.
2. قم بإعداد 50 مل من المحلول الملحي البارد PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) لغسل دماغ الفأر بالكامل.
3. قم بإعداد مجهر تشريح وإعداد الأدوات الجراحية اللازمة لتشريح الدماغ (المقص والملقط المعقمات) وعزل SCZ (حقنة 1 مل ، إبرة 30 جم ، مصفوفة دماغية ، ملقط دقيق).
4. تحضير N2 متوسط:
   1. تحضير F-12 / DMEM (+ L-glutamin ، + بيكربونات الصوديوم) المتوسطة مع 2٪ B27 ، و 1٪ N2 ، و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
      ملاحظة: يتكون وسط النمو من N2 متوسط وعوامل نمو (20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة المنقى (EGF) و 20 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF2)).
5. قم بإعداد عازل للهضم (40 وحدة / مل غراء ، 2.4 وحدة / مل ديسباز II ، و 2٪ بنسلين ستربتومايسين في PBS) لهضم الأنسجة.
6. تحضير لوحة الطلاء والغطاء:
   1. تحضير بولي إل أورنيثين (PLO ؛ 0.01٪) واللامينين (10 ميكروغرام / مل مذاب في DH₂O). لطلاء ألواح 6 آبار لصيانة SCZ-aNSCs (الخلايا الجذعية العصبية البالغة) كطبقة أحادية أو غطاء 18 مم للتلوين المناعي ، احتضنها مع PLO طوال الليل عند 4 درجات مئوية. ثم اغسلها 3 مرات باستخدام DH₂O. اترك الأطباق والأغطية تجف بعد الغسيل الأخير.
   2. بعد ذلك ، احتضن الألواح مع اللامينين طوال الليل عند 4 درجات مئوية. ثم اغسلها 3 مرات باستخدام DH₂O.
      تحذير: لا تجفف اللامينين ، مما سيؤثر على ارتباط الخلية.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدام محاليل الطلاء 3 مرات.

< p class = "jove_title" >2. عزل وانفصال SCZ البالغين

1. قبل تحضير المزرعة ، ضع مصفوفة الدماغ وشفرة الحلاقة ذات الحدين على الثلج.
   ملاحظة: لا تجمد مصفوفة الدماغ ، لأن الدماغ يمكن أن يلتصق بها.
2. التضحية بفأر (8 أسابيع) عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون₂ أو خلع عنق الرحم.
   1. قطع الرأس بمقص حاد بعد رش 70٪ من الإيثانول. لشل حركة الرأس ، أمسك جانبي الرأس بإحكام. قطع الجلد بالمقص عند خط الوسط في الاتجاه الذيلي. هذا يعزز الإزالة الكاملة للجلد من الجمجمة.
   2. قم بإزالة الجزء الذيلي من الجمجمة (الخلفي إلى لامدا) أولا ، ثم أدخل الملقط بين الجمجمة والدماغ في وضع خط الوسط الظهري. أمسك العظم الجداري الأيسر (أو الأيمن) وقشره بعناية. كرر هذا الإجراء لإزالة العظم الجداري الآخر.
      ملاحظة: يؤدي فصل العصب البصري وإزالة السحايا من الدماغ إلى تسهيل فصل الدماغ عن الجمجمة.
   3. انقل الدماغ إلى مخزن PBS البارد (25 مل) واشطفه مرتين لإزالة الدم الزائد.
3. ضع الدماغ في مصفوفة الدماغ على الجليد وقم بعمل جروح إكليلية للحصول على شرائح بسمك 1 مم. انقل شرائح الدماغ (1 مم) التي تحتوي على مناطق SCZ الموجودة في الجزء الخلفي من الدماغ إلى PBS بارد في طبق بتري بلاستيكي مقاس 35 مم.
   أنذر: من أجل الحصول على مستوى متوازي من الأقسام الإكليلية ، تأكد من وضع شق الدماغ في خط الوسط لمصفوفة الدماغ ؛ من الأهمية بمكان تجنب الاختلافات غير الضرورية في الأقسام.
   ملاحظه: الحصول على شرائح الدماغ في 2-3 مم خلف بريجما; هذا يسمح بفصل SCZ عن SVZ (المنطقة تحت البطينية).
4. تحت مجهر التشريح بتكبير منخفض ، قم بتشريح SCZ من منطقة المادة البيضاء في القشرة والحصين بإبرة 30G مثنية 6,9. ثم قم بإزالة مناطق القشرة فوق SCZ. ضع منطقة SCZ المقطوعة من الشرائح في طبق بتري بلاستيكي مقاس 35 مم على ثلج بدون PBS.
   ملاحظه: يمكن أن يؤثر تلوث المناطق الإضافية التي تحتوي على خلايا عصبية ناضجة على جدوى الخلايا العصبية العصبية وتكوين الغلاف العصبي لأنها تخضع لموت الخلايا في ظروف ثقافة aNSC.
5. باستخدام إبرة مثنية 30 جم ، قم على الفور بتقطيع الأنسجة المقطعة إلى قطع صغيرة.
   ملاحظه: إذا كانت هناك حاجة إلى وقت أطول لتشريح أنسجة SCZ ، فقم بغمر الأنسجة المقطعة في PBS البارد قبل التقطيع.
6. أعد تعليق الأنسجة المفرومة ب 1 مل من عازلة الهضم ، وانقل الأنسجة إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 2 مل من عازلة الهضم ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
   ملاحظه: رج الأنبوب كل 10 دقائق حتى يمتزج جيدا.

< p class = "jove_title" >3. زراعة الخلايا الجذعية العصبية البالغة المشتقة من المنطقة تحت الثفني

1. اضغط على الأنبوب برفق لفصل الأنسجة المهضومة ، ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 145 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الأنسجة المهضومة ب 1 مل من وسط N2 المسخن مسبقا لغسل المخزن المؤقت للهضم ، وقم بسحب محلول العينة برفق 5 مرات كحد أقصى باستخدام ماصة P1000.
   ملاحظه: يمكن أن يؤدي الإفراط في تناول الأنابيب بطرف ماصة ضيق إلى تقليل قابلية الخلية للحياة والنمو اللاحق.
2. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 145 × جم لمدة 5 دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط N2.
3. قم بإعداد 1 مل من وسط N2 في طبق غير مطلي من 6 آبار وأضف 1 مل من الخلايا العالقة لعمل حجم نهائي يبلغ 2 مل.
4. أضف EGF (20 نانوغرام / مل) و bFGF (20 نانوغرام / مل) في كل بئر. رج طبق المزرعة المكون من 6 آبار برفق يدويا لخلط عوامل النمو المضافة مع الخلايا المطلية. احتفظ بلوحة 6 آبار في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
5. أضف EGF (20 نانوغرام / مل) و bFGF (20 نانوغرام / مل) إلى كل بئر كل يوم لمدة 8 أيام. كل يوم ثالث ، أضف 200 ميكرولتر من وسائط N2 للحفاظ على الحجم التقريبي 2 مل من الوسط.

< p class = "jove_title" >4. مرور الخلايا العصبية كمجالات عصبية وإلى ثقافات أحادية الطبقة

1. اجمع المجالات العصبية وانقلها إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل.
   ملاحظة: كان عدد المجالات العصبية (>قطرها 50 ميكرومتر) لكل بئر من SCZ لدماغ فأر واحد 64.3 ± 7.31 ، وهو أقل من SVZ (190.5 ± 6.33).
2. احتضان المجالات العصبية ب 0.5 مل من المخزن المؤقت للتفكك لمدة 5 دقائق في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لفصل المجالات العصبية إلى خلايا مفردة. يمكن فصل المجالات العصبية الأولية إلى خلايا مفردة والحفاظ عليها على عدة ممرات كمجالات عصبية أو ثقافات أحادية الطبقة.
   ملاحظه: يتفوق توسيع SCZ-aNSCs كطبقة أحادية على المجالات العصبية لأن SCZ-aNSCs يمكن تمريرها >10 مرات في تنسيق ثقافة أحادية الطبقة ولكن <5 مرات في تنسيق ثقافة الغلاف العصبي.
   أنذر: تظهر SCZ-aNSCs تجميعا قويا ، ومن الصعب فصلها إلى خلايا مفردة. وبالتالي ، لا ينصح بتنسيق ثقافة الغلاف العصبي لتوسيع الخلايا الروتينية.
3. قم بسحب محلول العينة برفق لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P1000 أقل من 5 مرات وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 145 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق المجالات العصبية بمقدار 1 مل من وسط N2.
   ملاحظه: يمكن أن يؤدي الإفراط في المعايرة باستخدام طرف ماصة ضيق إلى تقليل صلاحية الخلية ونموها اللاحق.
4. لحساب الخلايا ، اصنع مزيجا بنسبة 1: 1 من معلق الخلية (10 ميكرولتر) ومحلول تريبان الأزرق 0.4٪ ، ثم احسب عدد الخلايا الحية على مقياس ضغط الدم. بعد طلاء صفيحة مكونة من 6 آبار باستخدام PLO / laminin ، قم بوضع الخلايا على شكل 2.5 × 105 خلية / مل مع 2 مل من وسط N2 لكل بئر.
   ملاحظه: يمكن أن تؤثر التغييرات في كثافة الخلايا على حالتها وإمكانات التمايز.
5. الحفاظ على SCZ-aNSCs مع العلاج اليومي لعوامل النمو (2 مل ، 20 نانوغرام / مل) لمدة 5 أيام ، ثم تمريرها.

< p class = "jove_title" >5. تمايز الخلايا الجذعية العصبية البالغة المشتقة من المنطقة تحت الثفني

1. ضع aNSCs على غطاء مطلي ب 18 مم مطلي ب PLO / Laminin مع 1 × 105 خلية / مل في 1 مل N2 مع عوامل نمو (20 نانوغرام / مل) لتمايز SCZ-aNSCs.
2. في اليوم التالي ، عندما ترتبط الخلايا بإحكام بالغطاء ، استبدل وسط النمو مع N2 لإزالة عوامل النمو.
3. بعد 6 أيام ، اغسل الخلايا المتمايزة ب 1 مل من PBS لإزالة بقايا الخلايا وإصلاحها للتلوين المناعي.
   ملاحظة: يمكن دمج BrdU في الحمض النووي المركب حديثا للخلايا المتكاثرة. لذلك ، إذا رغبت في ذلك ، يمكن إضافة BrdU (10 ميكروغرام / مل) إلى الخلايا الحية قبل تثبيت الخلايا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMEM / F12 جيبكو هاتف: 11320-033 L-glutamin ، بيكربونات الصوديوم القلم / البكتيريا العقدية إنفيتروجين 15140-122 مكمل N2 جيبكو 17502-048 مكمل B27 جيبكو 17504-044 bFGF البحث والتطوير 233-FB EGF جيبكو PHG0313 برنامج تلفزيوني (10X) الحل الحيوي BP007 أ 1X التخفيف HBSS جيبكو 14175-095 Dispase II روش 04-942-078-001 غراء ورثينجتون 3126 أكوتاز تكنولوجيا المعلومات في -104 ملقط ناعم WPI 555229F مقص شتورتس E3321-C مصفوفة الدماغ (1 مم) الدفع الخلفي 68707 ماكينة حلاقة ذات حدين دوركو ST-300 30 إبرة مقياس سونغشيم N1300 أنابيب 15 مل الاسكتلندي 50015 أنابيب 50 مل الاسكتلندي 50050 طبق 35 مم الاسكتلندي 10035 بيتريديش طبق 100 مم الاسكتلندي 10090 بيتريديش زلة الغطاء (18 مم) Deckglaser هاتف: 111580 12 طبق جيد الاسكتلندي 32012 غير مطلي 6 طبق جيد الاسكتلندي 32006 غير مطلي منظمه التحرير الفلسطينيه سيغما ص 4957 0.01٪ لامينين جيبكو 23017-015 10 ملغ/مل نيستين ميليبور MAB353 الماوس (1:1000) BrdU أبكام أب6326 جرذ (1:500) بنسلين الستربتومايسين تشريح المجهر الطرد المركزي ماصة P1000 حمام مائي حاضنة CO2 تريبان بلو مقياس الدم