إنشاء ثقافة مشتركة لخلايا لب الأسنان والخلايا العصبية ثلاثية التوائم للتواصل المتبادل

الملخص

المصدر: Barkley، C. et al.، طريقة زراعة مشتركة لدراسة نمو العصبيات استجابة لإشارات Paracrine لب الأسنان.J. Vis. Exp. (2020).

يعرض هذا الفيديو تقنية لإنشاء ثقافة مشتركة للخلايا العصبية ثلاثية التوائم وخلايا لب الأسنان الأولية باستخدام مرشح transwell. في هذه الحالة المنفصلة جسديا ، تفرز الخلايا الوسيطة التي يتم الحصول عليها من أنسجة لب الأسنان جزيئات إشارات paracrine التي تعبر المسام ، مما يعزز تمايز وهجرة الخلايا العصبية نحو الخلايا الوسيطة لإنشاء نظام زراعة مشتركة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير اللوحة

ملاحظة: تأكد من تشغيل غطاء اللوحة أثناء جميع خطوات الحضانة والشطف خارج غطاء مزرعة الأنسجة المعقمة لمنع التلوث أثناء معالجة العينات.

1. مرشحات الطلاء
   1. خفف اللامينين إلى 10 ميكروغرام / مل. قم بتصفية اللامينين المخفف تحت الغطاء.
   2. ماصة 450-500 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل لامينين في كل بئر من صفيحة 24 بئرا.
   3. ضع مرشح transwell ، مسامية 3 ميكرومتر ، في بئر بحيث يلامس محلول اللامينين ويترك في حاضنة 37 درجة مئوية إما لمدة ساعتين أو بين عشية وضحاها. يجب أن تسمح مسام المرشح لبعض المحلول بالانتشار وتغطية الجزء العلوي والسفلي من الفلتر. يجب استخدام هذه المرشحات في غضون 48 ساعة أو تبريدها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

فئة < p = "jove_title" >2. طلاء الخلية

1. الفئران: يمكن إجراء التغيير الجيني لخلايا لب الأسنان (DP) (ولكنه ليس مطلوبا) لدراسة التفاعلات الوسيطة العصبية.
2. تشريح DP وتشتته وطلاء (الشكل 1)
   ملاحظة: لتشريح DP ، استخدم ملقطا فائق الدقة ومستقيم الحواف. ستسمح الحواف فائقة الدقة للمستخدم بتثبيت حافة الملقط بين الهيكل المعدني وأنسجة DP.
   1. حصاد الفئران P5-P8. في هذه المرحلة ، يجب أن تكون الأسنان معدنية ، ويكون الجذر مفتوحا.
   2. تخدير حديثي الولادة عن طريق انخفاض حرارة الجسم عن طريق وضعهم في طبق في الثلاجة 4 درجات مئوية حتى لا يتحركوا أو يستجيبون للمس. القتل الرحيم لحديثي الولادة عن طريق قطع الرأس ووفقا لإجراءات اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) في المنشأة المخصصة.
   3. قم بإعداد 3-5 مل من حمض رباعي الأسيتيك 0.25٪ تريبسين إيثيلين ديامين (التربسين-EDTA) في أنبوب مخروطي سعة 50 مل لجمع DP من كل فأر. سيسهل ذلك هضم لب الأسنان من فئران ما بعد الولادة. استخدمي أكثر من 3 مل في حالة هضم أنسجة أكثر من 10 فئران بعد الولادة.
   4. ضع الرأس على وسادة سفلية يمكن التخلص منها بحيث يكون الفم باتجاه السقف وقاعدة الرقبة مسطحة على سطح العمل. استخدم شفرة حلاقة في حركة النشر لفصل الفك السفلي عن الفك العلوي.
   5. اختياريا ، قم بإزالة اللسان إما بالمقص أو بالملقط للسماح بالوصول بسهولة إلى الأضراس.
   6. ضع الرأس المفتوح في طبق فوق وسادة شاش معقمة وضع العينة تحت مجهر تشريح (الشكل 1 د).
   7. قم بإزالة أنسجة العظام السنخية المحيطة بالأضراس الأولى. لا تنبثق الأسنان تحت الفك السفلي بالكامل في هذه المرحلة. أدخل ملقطا في الفتحة السنخية وقم بإثارة الأنسجة بعيدا عن السن باتجاه الجانب الشدقي (الخد) أو اللسان (اللسان) من الفم. تتطلب أسنان الفك العلوي إزالة الشق حول السن بالكامل للتعرض والإزالتها.
   8. انقل الأضراس الأولى تحت الفك السفلي والفك العلوي برفق (M1s) إلى طبق ثقافة خلوي منفصل مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS).
   9. كرر 2.2.4-2.2.8 حتى يتم جمع جميع M1s. احتفظ بالطبق الذي يحتوي على M1s على الجليد أثناء الحصاد.
   10. قم بإزالة العضو الخارجي للمينا (EOE) المحيط بالجزء الخارجي من كل M1. يمكن القيام بذلك بدلا من ذلك بعد الخطوة 2.2.11.
   11. باستخدام مجموعة من الملقط ، قم بتدوير M1 بحيث تكون الشرفات لأسفل ويكشف الجذر المفتوح. ستكون هناك فتحة بيضاوية في الجزء السفلي من السن ، وأنسجة DP غير شفافة مغلفة بطبقة رقيقة من العاج والمينا.
   12. باستخدام طرف الملقط ، قم بفك DP برفق عن طريق تمرير ذراع واحدة من الملقط حول المحيط الداخلي للأنسجة المعدنية. قم بإزالة أنسجة DP من الهيكل المعدني ونقلها إلى طبق ثالث يحتوي على 1x PBS. قم بإزالة EOE إذا لم يكن مفصولا بالفعل (الشكل 1E).
   13. انقل جميع أنسجة DP إلى 0.25٪ تريبسين EDTA في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. دوامة الخليط وضعه في حمام ماء دافئ 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. يمكن القيام بذلك بنفس الملقط أو باستخدام ملقط قارورة طويلة. سيكون من الصعب تشتيت الأنسجة وستتطلب دوامة كل 3-4 دقائق. لا تتجاوز 10 دقائق من التربسين لأن التربسين يمكن أن يتلف أغشية الخلايا.
   14. تحت غطاء معقم ، أضف وسائط الزراعة المشتركة الدافئة (الجدول 1) إلى النسبة النهائية التي لا تقل عن 1: 1 إلى التربسين لتعطيل الإنزيم. النسب الأكبر مقبولة إذا كان هناك رغبة في زيادة تشتت الأنسجة.
   15. قم بتثبيت الوسائط لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام ماصة سعة 10 مل لزيادة تشتيت DP في الوسائط. احرص على تجنب الفقاعات الكبيرة. يكاد يكون التشتت الكامل مستحيلا بسبب الطبيعة اللزجة للأنسجة. ومع ذلك ، فإنه ليس ضروريا أيضا لأن الخلايا ستنتقل إلى الخارج من الأنسجة بمجرد طلاءها.
   16. انقل 1 مل من DP المشتت إلى كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا (الشكل 1F).
   17. ضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية واسمح للخلايا بالالتصاق والهجرة من الأنسجة غير المشتتة لمدة 48 ساعة قبل تغيير الوسائط. تحتاج الخلايا الأولية إلى الطلاء بتركيزات عالية نسبيا من أجل الوصول إلى 85-90٪ التقاء في غضون أسبوع واحد. إذا لم يتحقق ذلك بعد 1 أسبوع ، فتخلص من اللوحة.
3. تشريح الخلايا العصبية ثلاثية التوائم وتشتتها وطلاءها
   ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم تحسين تصوير نمو الخلايا العصبية في الزراعة المشتركة مع خلايا DP باستخدام B6 للمراهقين (6 أسابيع). Cg-Tg (Thy1-YFP) 16Jrs / J الفئران. يحتوي الجهاز العصبي المركزي والمحيطي للفئران Thy1-YFP على علامة بروتين فلوري أصفر (YFP) يبدأ تعبيره حول P6-P10 في الخلايا العصبية ويزداد بشكل كبير في جميع أنحاء الجهاز العصبي خلال فترة ما بعد الولادة وحياة البالغين. حافظت YFP و GFP على تسلسلات تسمح بتلطيخ هذه الأعصاب بالأجسام المضادة ل GFP ، مما يؤدي إلى ظهور بقعة خلوية عصبية. في النهاية ، تسمح هذه الفئران بتصور وتقدير أفضل للخلايا العصبية المستخدمة والنمو في زراعة الخلايا.       
   1. قتل الفئران المراهقة بثاني أكسيد الكربون متبوعا بخلع عنق الرحم.
   2. اقطع رأس الفئران وقم بإزالة الجلد من الجمجمة. تأكد من تضمين أعداد مكافئة من الذكور والإناث.
   3. أدخل طرف زوج من مقصات التشريح الدقيقة في قاعدة الجمجمة. قطع على طول خياطة السهمية للجمجمة (الشكل 1 أ).
   4. قم بعمل أربع قطع أفقية صغيرة: اثنان على طول الغرز الإكليلية بالأذنين ، واثنان على طول الغرز اللامدوية عند قاعدة الجمجمة. هذا يجب أن يخلق سدائل من العظام.
   5. استخدم الملقط لتقشير سدائل العظام. هذا يجب أن يكشف الدماغ.
   6. إزالة الدماغ. انقل الرأس إلى طبق زراعة الأنسجة مع 1x PBS وضعه تحت المجهر.
   7. حدد موقع العقد ثلاثية التوائم (TG) ، والتي يمكن رؤيتها بسهولة في القوارض¹³ ، الموجودة في الأم الجافية بين الدماغ والعظام في عملية الفك العلوي (الشكل 1 ب).
   8. قم بقص الفروع الثلاثة التي تنتقل إلى العينين والفك العلوي والفك السفلي وانقل العقد إلى 1x PBS البارد باستخدام ملقط رفيع مستقيم الحواف. احتفظ بالطبق الذي يحتوي على العقد TG على الجليد أثناء الحصاد.
   9. بمجرد حصاد جميع حزم TG ، انقل العقد إلى أنبوب مخروطي 50 مل يحتوي على 5 مجم / مل من الكولاجيناز المصفى المعقم من النوع الثاني باستخدام ملقط قارورة.
   قم
   10. بتدوير الكولاجيناز باستخدام حزمة TG وضع الأنبوب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 25-30 دقيقة. خلال هذا الوقت ، أخرج الأنبوب المخروطي من الحمام المائي ، الدوامة ، والعودة إلى الحمام كل 5-10 دقائق.
   11. جهاز طرد مركزي لمحلول الخلايا العصبية الكولاجيناز-TG لمدة دقيقتين عند 643 × جم.
   12. تحت غطاء مزرعة الأنسجة، قم بشفط الكولاجيناز برفق باستخدام ماصة دقيقة.
   13. أضف 5 مل من التربسين المصفى بمعقم بنسبة 1٪ من النوع الثاني والدوامة. ضع الأنبوب المخروطي في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   14. جهاز طرد مركزي مزيج التربسين-TG لمدة 5 دقائق عند 643 × جم. قم بإزالة الجزء العلوي من التربسين باستخدام ماصة دقيقة، حتى لا تتم إزالة الخلايا العصبية TG. سيظل هناك سائل في الأنبوب.
   15. أضف وسائط كافية لإلغاء تنشيط التربسين المتبقي (بنسبة 1: 1 أو أقل من التربسين إلى الوسائط).
   16. احسب عدد الخلايا وخفف المحلول إلى 200,000 خلية / مل (250 ميكرولتر من 50,000 خلية تحتوي على خلية).
   17. ضع مرشحات الآبار المطلية من القسم 1.2 في الآبار مع DP.
   18. خفف المحلول المحتوي على الخلية بحيث يكون هناك 200,000 خلية / مل. ماصة 250 ميكرولتر على مرشح transwell ، وزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (الشكل 1F).
   19. في اليوم التالي ، استبدل الوسائط ب 1 مل من وسائط الزراعة المشتركة مع 1 ميكرومتر من الأوريدين و 15 ميكرومتر 5'-fluoro-2 deoxyuridine لوقف التكاثر المفرط للخلايا الوسيطة التي قد تمنع نمو الخلايا العصبية. اختياري: أضف عوامل النمو أو المثبطات في هذه الوسائط إذا حاولت المزيد من التلاعب.

الجدول 1: وسائط الثقافة المشتركة.

مكون حجم تركيز α MEM 440 مل مصل بقري الجنين المعطل بالحرارة 50 مل 10٪ 100x L-glutamine 5 مل 1x البنسلين الستربتومايسين 100 × 5 مل 1x تغيير الوسائط في اليوم 2 مع مثبطات الانقسام في هذه التركيزات النهائية أردين 1 ميكرومتر 5'-فلور-2'ديوكسيوريدين 15 ميكرومتر

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تخطيطي لتشريح الفأر للحصول على خلايا للزراعة المشتركة.(أ) رسم تخطيطي لمكان القطع لفتح جمجمة الفأر وتحديد موقع أعصاب TG ، كما هو موضح باللون الأسود في الصورة الأخيرة. يشير المقص إلى مكان إدخال أطراف المقص للقطع على طول الخطوط المنقطة. (ب) صورة مدمجة للحقل المظلم و GFP تظهر أعصاب Thy1-YFP + TG محاطة بدائرة باللون الأبيض. (ج) يمكن بع...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 5-فلورو-2'-ديوكسي يوريدين سيجما ألدريتش F0503 يستخدم كمثبط انقسامي بتركيز 15 ميكرومتر في وسط الزراعة المشتركة ، اليوم 2 24 لوحة ثقافة خلية البئر كورنينج 3524 لوحة الثقافة المشتركة ب 6 ؛ 129- Tgfbr2tm1Karl/J مختبر جاكسون هاتف 12603 نموذج الفأر Tgfbr2f / f المستخدم لخلايا لب الأسنان في بروتوكول محسن ب 6. CG-Tg (Thy1-YFP) 16Jrs / J مختبر جاكسون 3709 النمط الجيني لنموذج الفأر Thy1-YFP المستخدم في الخلايا العصبية ثلاثية التوائم الكولاجيناز النوع الثاني ميليبور 234155-100 ملغ تستخدم لتفريق الخلايا العصبية ثلاثية التوائم مصل الأبقار الجنينية جيبكو هاتف 10437 مادة مضافة لوسائط الثقافة المشتركة ملقط ناعم أدوات العلوم الدقيقة 11413-11 ملقط دقيق لتشريح TG لامينين سيجما ألدريتش L2020 يغطي إدخالات الثقب عند التركيز النهائي البالغ 10 ميكروغرام / مل ، ويفترض أن محلول المخزون يبلغ 1.5 مجم / مل ل-جلوتامين جيبكو 25030081 مادة مضافة لوسائط الثقافة المشتركة مقص التشريح الدقيق سيجما ألدريتش S3146-1EA مقص تشريح لفتح الجمجمة الحد الأدنى من الوسط الأساسي أ جيبكو 12571063 قاعدة إعلامية للثقافة المشتركة البنسلين - ستربتومايسين جيبكو 15070063 مضاف مضاد حيوي لوسائط الاستزراع المشترك مثبطات الفوسفاتيز سيجما ألدريتش 04 906 837 001 مادة مضافة إلى RIPA Buffer لاستخراج البروتين من خلايا لب الأسنان بعد الزراعة المشتركة إدراج ثقافة الخلايا ThinCert غرينر بيو ون 662631 إدخالات Transwell للخلايا العصبية ثلاثية التوائم في فحوصات الزراعة المشتركة التربسين EDTA (0.25٪) جيبكو 25200056 تستخدم FTO لتفريق خلايا لب الأسنان التربسين النوع الثاني سيجما ألدريتش تي -7409 تستخدم لتفريق الخلايا العصبية ثلاثية التوائم ملقط فائق الدقة أدوات العلوم الدقيقة 11370-40 ملقط فائق الدقة للتشريح أردين سيجما ألدريتش طراز U3750 يستخدم كمثبط انقسامي بتركيز 1 ميكرومتر في وسط الزراعة المشتركة ، اليوم 2 ملقط قارورة أدوات العلوم الدقيقة 110006-15 ملقط طويل لنقل الأنسجة إلى المخاريط