إنشاء ثقافة مشتركة للخلايا العصبية الداخلية مع الخلايا البطانية حول البطينين

الملخص

المصدر: Datta, D., et al. فحوصات الهجرة والجذب الكيميائي والزراعة المشتركة للخلايا البطانية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية والخلايا العصبية GABAergic. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو تقنية لإنشاء ثقافة مشتركة للخلايا العصبية الداخلية مع الخلايا البطانية حول الأوعية الدموية. تضاف الخلايا إلى ملحق بئر واحد يوضع داخل طبق ثقافة. بعد أن تلتصق الخلايا بالطبق ، تتم إزالة الملحق ، مما يسمح للخلايا بالتكاثر والتفاعل وتشكيل ثقافة مشتركة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. ثقافة وتخزين الخلايا البطانية البشرية حول البطينين

1. الحفاظ على الخلايا البطانية المحيطة بالبطينين البشرية على ألواح 6 آبار مغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي (انظر جدول المواد) في وسط الخلية البطانية حول البطينين (وسط E6 يحتوي على 50 نانوغرام / مل عامل نمو البطانية الوعائية A [VEGF-A] ، 100 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية 2 [FGF2] و 5 ميكرومتر حمض جاما أمينوبوتيريك [GABA]) عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. قم بتغيير الوسيط كل يوم بديل.
2. قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي في 4 درجات مئوية ، واصنع محلولا 1: 100 عن طريق تخفيفه في وسط النسر المعدل / خليط المغذيات البارد من Dulbecco F-12 (DMEM / F12). قم بتغطية كل بئر من صفيحة 6 آبار ب 1 مل من محلول المصفوفة. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل الاستخدام.
3. السماح للخلايا البطانية حول البطينين البشرية بالوصول إلى التقاء 80٪ -90٪. وسط الشفط من البئر. اغسل الآبار مرة واحدة ب 1 مل من محلول ملحي معقم 1x مخزن بالفوسفات (PBS) لكل بئر.
4. افصل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من محلول تفكك الخلايا (انظر جدول المواد) لكل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد 5 دقائق ، أضف 1 مل من وسط الخلية البطانية حول البطينين. انقل محلول الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
   ملاحظه: نستخدم Accutase لتفكك الخلايا هنا ، على عكس TrypLE في القسمين 3 و 4.
5. خلايا الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، تشبح المادة الطافية وتعيد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط الخلية البطانية حول البطينين.
6. عد الخلايا الحية باستخدام طريقة استبعاد trypan blue. خلايا البذور في صفائح طازجة مغلفة بمصفوفة بكثافة 1.2 × 10⁵ خلايا / سم². احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
7. قم بتخزين الخلايا البطانية حول البطينين البشرية عن طريق الحفظ بالتبريد في وسط التجميد (90٪ وسط الخلية البطانية حول البطينين و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد [DMSO]).
   1. فصل الخلايا وجمعها باتباع الخطوتين 1.3 و 1.4 أعلاه. عد الخلايا في الحل بطريقة استبعاد trypan blue.
   2. خلايا الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية عند 5 × 10⁶ خلايا / مل من وسط التجميد.
   3. قم بتوزيع 1 مل من وسط التجميد بالإضافة إلى الخلايا لكل تبريد. ضع القوارير في حجرة مملوءة بالأيزوبروبانول واتركها تبرد طوال الليل في -80 درجة مئوية عند 1 درجة مئوية / دقيقة. انقل القوارير إلى خزان النيتروجين السائل في اليوم التالي للتخزين طويل الأجل.

< p class = "jove_title" >2. تحضير الخلايا البطانية حول البطينين البشرية للفحص

1. السماح للخلايا البطانية حول البطينين البشرية بالوصول إلى 70٪ -80٪ التقاء.
2. فصل الخلايا باتباع الخطوات من 1.3 إلى 1.5 كما هو موضح أعلاه. عد الخلايا باستخدام طريقة استبعاد trypan blue.

فئة < ص = "jove_title" >3. إعداد الخلايا العصبية الداخلية GABAergic البشرية للفحص

< ص الفئة = "jove_content" >ملاحظة: تم شراء الخلايا العصبية الداخلية GABAergic المستمدة من الإنسان (iPSC) تجاريا (انظر جدول المواد). يتم إنشاء الخلايا العصبية عن طريق التمييز بين خط iPSC المشتق من الخلايا الليفية البشرية باتباع بروتوكول وضعته الشركة المصنعة. تم إذابة الخلايا وزراعتها وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

1. قم بإذابة الخلايا العصبية الداخلية GABAergic البشرية وزراعتها في صفيحة 12 بئر لمدة أسبوعين إلى التقاء 70٪ -80٪.
2. في يوم الفحص ، محلول تفكك الخلايا الدافئة (انظر جدول المواد) وكمية من الوسط العصبي عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل الاستخدام.
وسط
3. الشفط من كل بئر يحتوي على الخلايا. اغسل الخلايا ب 1 مل من 1x PBS المعقم لكل بئر.
4. افصل الخلايا عن طريق إضافة 0.5 مل من محلول التفكك الدافئ مسبقا لكل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أضف 1 مل من الوسط العصبي لكل بئر. نقل محلول الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل. تريتورات بلطف لفصل كتل الخلايا.
5. خلايا الطرد المركزي عند 380 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، تشبح المادة الطافية وتعيد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من الوسط العصبي. عد الخلايا الحية باستخدام طريقة استبعاد trypan blue.

< p class = "jove_title" >4. تحضير التحكم في الخلايا البطانية البشرية للفحص

< ص فئة = "jove_content" >ملاحظة: تم شراء الخلايا البطانية المشتقة من iPSC البشرية ووسط الخلية البطانية تجاريا (جدول المواد). يتم إنشاء هذه الخلايا البطانية عن طريق التمييز بين خط iPSC المشتق من الخلايا الليفية البشرية إلى مصير البطانة باتباع بروتوكول وضعته الشركة المصنعة. تم إذابة الخلايا وزراعتها على ركيزة فيبرونيكتين وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تحضير الألواح المطلية بالفبرونكتين وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

1. قم بإذابة الجليد ، وتحكم في الخلايا البطانية البشرية ، وزرعها في صفيحة مكونة من 6 آبار ، إلى التقاء 80٪ -90٪.
2. في يوم الفحص ، محلول تفكك الخلايا الدافئة (انظر جدول المواد) وكمية من الوسط البطاني عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل الاستخدام.
3. استنشق الوسط من كل بئر يحتوي على الخلايا. اغسل الخلايا ب 1 مل من 1x PBS المعقم لكل بئر.
4. افصل الخلايا عن طريق إضافة 0.5 مل من محلول التفكك الدافئ مسبقا لكل بئر. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. أضف 1 مل من وسط الخلية البطانية لكل بئر لتحييد محلول التفكك. نقل محلول الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
5. خلايا الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. شفط طافي وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط الخلية البطانية. عد الخلايا الحية باستخدام طريقة استبعاد trypan blue.

< p class = "jove_title" >5. تحضير إدخالات ثقافة بئر

واحدة

1. قم بإذابة محلول 1 مجم / مل من محلول اللامينين في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
2. قم بتغطية عدد مناسب من الأطباق مقاس 35 مم بمحلول بولي إل أورنيثين بنسبة 0.01٪ (1 مل لكل طبق). احتضان الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل.
3. خفف 1 مجم / مل محلول لامينين 1: 300 في ماء معقم إلى تركيز نهائي يبلغ 3.3 ميكروغرام / مل مباشرة قبل الاستخدام.
4. استنشق بولي إل أورنيثين تماما من كل طبق. اشطف كل طبق جيدا 3 مرات بالماء المعقم واستنشق تماما لتجنب سمية الخلايا التي يسببها بولي إل أورنيثين.
5. أضف 1 مل من محلول اللامينين 3.3 ميكروغرام / مل إلى كل طبق واحتضنه عند 37 درجة مئوية طوال الليل أو 1 ساعة على الأقل. قم بإزالة محلول اللامينين من الطبق مباشرة قبل الاستخدام.
   ملاحظه: بدلا من ذلك ، قم بتخزين الأطباق المحتوية على اللامينين في 4 درجات مئوية ، وقم بموازنة الأطباق في حاضنة زراعة الخلايا 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
6. قم بقص ثلاثة جوانب لبئر واحد من ملحق ثقافة سيليكون بئرين (الشكل 1 أ) باستخدام شفرة معقمة لإنشاء ملحق بئر واحد (الشكل 1 ب).< / > ملاحظه: احتفظ بالملحق المكون من بئرين مثبتا بإحكام على سطح العبوة الأصلية أثناء القطع لضمان قطع سلس وحماية الالتصاق للإدخال.
7. شفط محلول اللامينين من الأطباق.
   ملاحظه: لا تغسل الأطباق ب PBS المعقم أو الماء بعد حضانة اللامينين. ستمنع الأسطح الرطبة الالتصاق بإحكام لإدراج الثقافة.
8. قم بإزالة الحشوة ذات البئر الواحد باستخدام ملاقط معقمة وضعها في وسط الطبق المغطى ب poly-L-ornithine / laminin. اضغط على طول حواف الملحق لتثبيته على سطح الطبق.
9. اقلب الطبق رأسا على عقب بعناية للتحقق من أن الملحق ملتصق بإحكام.
10. احتفظ بالطبق رأسا على عقب وحدد حدود حجرة الإدخال باستخدام علامة سوداء دائمة بطرف فائق النعومة (الشكل 1 ج).

6. مقايسة الهجرة للثقافة المشتركة

شارك
1. في تعليق 3 × 10⁴ الخلايا العصبية الداخلية GABAergic و 3 × 10⁴ خلايا بطانية حول البطينين البشرية في 70 ميكرولتر من وسط الزراعة المشتركة (50٪ وسط صيانة حول البطينين بدون GABA و 50٪ وسط عصبي). قم بزرع محلول الخلية هذا داخل حجرة إدخال البئر الواحدة. قم بإعداد عدد مناسب من أطباق الفحص.
   ملاحظه: لم تتم إضافة GABA في وسط الاستزراع المشترك لاستبعاد تأثير GABA الخارجية على الهجرة.
2. تحقق تحت المجهر للتحقق من عدم تسرب الخلايا من حجرة الإدخال.
3. أضف ببطء 1 مل من وسط الزراعة المشتركة على طول جانب الطبق لمنع الطلاء من الجفاف.
   ملاحظه: أضف الوسط ببطء على طول حافة الطبق حتى لا يتم إزعاج الإدراج.
4. كعنصر تحكم أول, البذور 3 × 10⁴ الخلايا العصبية الداخلية GABAergic البشرية فقط في 70 ميكرولتر من وسط الزراعة المشتركة لكل إدراج بئر واحد. قم بإعداد عدد مناسب من هذه الأطباق.
5. كعنصر تحكم ثان ، تتحكم الخلايا العصبية الداخلية البشرية المشتركة 3 × 10⁴ GABAergic مع 3 × 10⁴ في الخلايا البطانية البشرية في 70 ميكرولتر من وسط الزراعة المشتركة لكل إدراج بئر واحد. تحضير عدد مناسب من الأطباق.
6. احتضن الأطباق لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. بعد 24 ساعة من الحضانة ، تحقق تحت المجهر للتحقق من أن الخلايا قد تلتصق بشكل صحيح وعدم وجود تسرب.
7. بعد 48 ساعة من البذر ، قم بإزالة الملحق برفق باستخدام ملقط معقم. تحقق تحت المجهر للتحقق من عدم إزعاج طبقة الخلية (اليوم 0).
8. قم بإزالة الوسط وأضف 1 مل من وسط الزراعة المشتركة الطازجة.
   ملاحظه: خصص عددا مناسبا من الأطباق للحصول على صور اليوم 0.
9. احتضان الخلايا لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تحضير إدراج الثقافة. (أ) إدراج ثقافة بئرين. (ب) ملحق بئر واحد مثبت في وسط طبق 35 مم. (ج) الخطوط العريضة للرقعة المستطيلة كما لوحظ بعد إزالة الحشوة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حل تفكك Accutase ميليبور سيجما SCR005 محلول تفكك الخلايا (للخلايا البطانية حول البطينين، الخطوة 1.4) السيطرة على الخلايا البطانية البشرية الديناميكيات الخلوية التوصية 1022 مكمل التحكم في الخلايا البطانية المتوسطة الديناميكيات الخلوية م 1019 قوارير مبردة فيشر ساينتيك 03-337-7 سنوات DMEMF / 12 متوسط ثيرموفيشر العلمي 11320033 DMSO سيجما ألدريتش د2650 E6 متوسط ثيرموفيشر العلمي A1516401 FGF2 ثيرموفيشر العلمي PHG0261 فيبرونيكتين ثيرموفيشر العلمي 33016-015 حاوية التجميد ثيرموفيشر العلمي 5100 GABA سيجما ألدريتش أ 2129 مقياس الدم سيجما ألدريتش Z359629 الخلايا العصبية GABAergic البشرية الديناميكيات الخلوية R1013 الخلايا العصبية البشرية GABAergic قاعدة المتوسطة الديناميكيات الخلوية M1010 الملحق العصبي العصبي GABAergic البشري الديناميكيات الخلوية م 1032 لامينين سيغما L2020 ماتريجيل كورنينج 356230 مصفوفة الغشاء القاعدي تصاعد متوسط مختبرات النواقل إتش-1200 بولي إل أورنيثين سيغما ص 4957 برنامج تلفزيوني ثيرموفيشر العلمي 14190 تريبان بلو ثيرموفيشر العلمي 15250061 تريبل ثيرموفيشر العلمي 12563011 حل تفكك الخلايا (للخلايا العصبية الداخلية GABAergic والخلايا البطانية ، القسمين 3 و 4) فيجف أ بيبروتك 100-20 مجموعة VascuLife VEGF المتوسطة الكاملة تقنيات خلايا شريان الحياة ل ل -0003 مكون من وسيط الخلية البطانية البشرية للتحكم 2-ثقافة سيليكون جيدا - إدراج المرجع نفسه 80209 3 - ثقافة سيليكون جيدا - إدراج المرجع نفسه 80369 طبق 35 مم كورنينج 430165 أنبوب مخروطي سعة 15 مل فيشر ساينتيك 07-200-886 محلول PFA 4٪ فيشر ساينتيك AAJ19943K2 لوحة ثقافة الأنسجة 6 آبار فيشر ساينتيك 14-832-11