إنشاء ورم في المخ في نموذج الزراعة المشتركة للشرائح العضوية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Chadwick، E. J. et al. ورم في المخ / نظام زراعة مشترك للشريحة العضوية لدراسة البيئة المكروية للورم والعلاجات الدوائية المستهدفة. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو تطوير نظام ثقافة مشتركة ثلاثية الأبعاد. توضع شرائح دماغ الفأر على غشاء ، ويسمح لخلايا ورم الدماغ البشري المسمى بالفلورسنت بالنمو عليه. بمجرد أن يصبح النظام جاهزا ، يتم تلطيخه للتصوير.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. طلاء الشرائح على الإدخالات

1. املأ كل بئر من صفيحة 6 آبار ب 1,200 ميكرولتر من وسائط زراعة الشرائح. املأ أي آبار غير مستخدمة ب 1,200 ميكرولتر PBS واملأ المساحة المركزية للوحة ب 5 مل 1x PBS. قم بتخزين هذا الطبق في درجة حرارة 37 درجة مئوية.
2. باستخدام أداة الملعقة المشقوقة ، ضع شريحة من الدماغ في الوسائط الموجودة على الملحق ، وادفع الشريحة برفق ليتم غمرها بالكامل. كرر لجميع الشرائح.
3. استخدم p1000 لسحب 1 مل من وسائط زراعة الشرائح من أعلى الملحق وتوزيعها في قاع البئر. قم بإزالة الوسائط الزائدة والتخلص منها حتى تصبح حواف الاغاروز حول شريحة الدماغ مرئية. افعل هذا للشرائح المتبقية.
4. التقط الملحق من الحافة بالملقط ، وقم بإمالة وإزالة الوسائط الزائدة. بعد ذلك ، انقل الملحق بسرعة إلى طبق 35 مم² يحتوي على 1 مل من وسائط زراعة الشرائح. استخدم زوجين من الملقط الحاد لإزالة الاغاروز حول الأنسجة ، مع الحرص على عدم التمدد / التلف أو تقطيع أو إحداث ثقب في الغشاء (أسهل إذا قمت بتمزق حافة الاغاروز ، ثم قم بتفكيك الاغاروز من أي جانب). ثم انقل الملحق مرة أخرى إلى الطبق المكون من 6 آبار وكرر العملية مع الشرائح المتبقية.
5. في غطاء مزرعة الأنسجة مع إيقاف تشغيل المنفاخ (لمنع شرائحها من الجفاف) ، قم بإزالة شظايا الاغاروز من كل غشاء.
6. انقل الشرائح إلى الطبق المكون من 6 آبار المحضر في الخطوة 1.1 وقم بتخزين الطبق على حرارة 37 درجة مئوية. احتضن الشرائح لمدة 24-48 ساعة.

2. تغيير وسائط ثقافة الشريحة

1. كرر الخطوة 1.1 مع طبق جديد من 6 آبار.
2. في غطاء مزرعة الأنسجة مع إيقاف تشغيل المنفاخ ، انقل الإدخالات إلى ألواح جديدة مكونة من 6 آبار تحتوي على وسائط شرائح جديدة.

< p class = "jove_title" >3. طلاء الخلايا السرطانية على الشريحة

1. قم بتسخين صبغة Cm-DiI وتدور على سرعة متوسطة لمدة 2 دقيقة.
2. قم بتدوير الخلايا السرطانية المستخدمة للتراكب عند 201 × جم لمدة 5 دقائق. ثم أعد تعليقها في 2 مل من وسائط زراعة الشرائح.
3. أضف 7 ميكرولتر من Cm-DiI إلى 2 مل من الخلايا والوسائط واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
4. قم بتدوير الخلايا عند 201 × جم لمدة 5 دقائق وأعد تعليقها في 200 ميكرولتر من وسائط التقطيع. ثلاثي الأبعاد برفق لفصل الخلايا (10-20 مرة أو حتى تختفي الحبيبات) ثم أضف 800 ميكرولتر وسائط تقطيع لتكوين حجم إجمالي يبلغ 1,000 ميكرولتر.
5. عد الخلايا السرطانية القابلة للحياة باستخدام Trypan blue. أضف كريات فلورية خضراء إلى الخلايا السرطانية بنفس تركيز الخلايا. ستكون هذه الكريات المجهرية الخاملة بمثابة عنصر تحكم. قم بتدوير خليط الخلية / الكرة المجهرية عند 201 × جم لمدة 5 دقائق وأعد تعليقه في الكمية المطلوبة من وسائط زراعة الشرائح. خلايا صفيحية بكثافة 6,000 خلية / شريحة بحجم 65 ميكرولتر. يمكن زيادة عدد الخلايا المطلية لكل شريحة حسب التفضيل والتوافر.
6. في غطاء مزرعة الأنسجة ، قم بتوزيع الخلايا في 65 ميكرولتر من الوسائط / الشريحة على مركز الشريحة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات هيبس إنفيتروجين 17504044 الجلوكوز إنفيتروجين 17502048 بينيسيلين ستربتومايسين تقنيات الحياة 15140-122 HBSS تقنيات الحياة 14185-052 ب -27 تقنيات الحياة 17504-044 N2 تقنيات الحياة 17502-048 جلوتاماكس تقنيات الحياة 35050061 Neurobasal-A- متوسط ناقص الفينول الأحمر إنفيتروجين 12349015 نقطة انصهار منخفضة الاغاروز بروميجا V2111 إدراج ثقافة الشريحة ميليبور PICM0RG50 لامينين إنفيتروجين 23017015 سم - دي آي إنفيتروجين الطراز V22888 الكريات المجهرية تقنيات الحياة إف -21010