مقالة منهجية

دراسة تجديد الوصلات الوظيفية بين شرائح الحبل الشوكي باستخدام مصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Heidemann, M., et al. التحقيق في التجديد الوظيفي في الثقافات المشتركة للحبل الشوكي العضوي المزروعة على مصفوفات متعددة الأقطاب الكهربائية. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح الفيديو التجديد الوظيفي للوصلات النخاعية باستخدام مقايسة قائمة على مصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية (MEA). توضع شرائح الحبل الشوكي على منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا ويسمح لها بالاندماج. يتم فصل الشرائح المنصهرة ميكانيكيا عن طريق إنشاء آفة ، مما يحفز الخلايا العصبية النخاعية على النمو فوق الآفة وربط الشرائح. يتم تقييم النشاط الكهربائي للشرائح لتحديد تجديد التوصيلات الوظيفية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الاتفاقات البيئية المتعددة

الأطراف

ملاحظة: تتكون MEAs من ركيزة زجاجية وأقطاب معدنية دقيقة التصنيع وطبقة عازلة من البوليمر SU-8. لغرض هذه الدراسة ، تم طلب MEAs المتاحة تجاريا بتخطيط مصفوفة أقطاب كهربائية مخصص (الشكل 1 A & B). يتم ترتيب الأقطاب الكهربائية ال 68 في شبكة مستطيلة مقسمة إلى منطقتين بواسطة أخدود بعرض 300 ميكرومتر خال من الأقطاب الكهربائية والأسلاك الكهربائية والعزل. يبلغ حجم كل قطب كهربائي 40 × 40 ميكرومتر ومتباعدهما بمقدار 200 ميكرومتر من مركز إلى مركز. يتم وضع أربعة أقطاب كهربائية أرضية كبيرة حول موقع التسجيل. وهي تختلف عن غيرها من الاتفاقات البيئية القياسية المتاحة تجاريا في حجمها (21 مم × 21 مم) ولا تحتوي على غرفة تسجيل ثابتة.

  1. للتطهير ، اشطف MEAs في 100٪ إيثانول (2x) و 70٪ إيثانول (1x) والماء المقطر (2x) لمدة 30 ثانية على الأقل لكل منهما. دعها تجف. ضع 10 - 12 MEAs في طبق بتري زجاجي نظيف (150 مم × 25 مم) وأغلق الغطاء.
  2. الأوتوكلاف MEAs لمدة 20 دقيقة عند 120 درجة مئوية.
  3. قم بإعداد محلول الطلاء (انظر قائمة المواد) للمناطق المتوسطية وتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية.
  4. ضع كل MEA في طبق بتري معقم فردي (35 مم × 10 مم).
  5. استخدم ماصة مبردة لوضع محلول طلاء مبرد سعة 150 ميكرولتر فوق الأقطاب الكهربائية وإغلاق غطاء طبق بتري. بعد حوالي 10 دقائق ، تحقق من وجود فقاعات هواء أعلى الأقطاب الكهربائية وقم بإزالتها برفق باستخدام ملعقة مغطاة بالمطاط إذا لزم الأمر. اتركه يرتاح لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  6. بقايا محلول طلاء الشفط ، اغسل 1x بوسط محسن للخلايا العصبية قبل الولادة والجنينية و 2x بالماء المقطر والمعقم. إذا لم يتم استخدام MEAs حتى اليوم التالي ، احتفظ بها في ماء مقطر ومعقم عند 37 درجة مئوية في الحاضنة طوال الليل (O / N). خلاف ذلك ، اتركه يجف مباشرة في RT.
< p class = "jove_title" >2. المكونات المطلوبة لإعداد ونمو ثقافات النمط العضوي

  1. تحضير محلول غسيل خال من الكالسيوم (انظر قائمة المواد).
  2. أعد تكوين بلازما الدجاج في محلول الغسيل (1: 1 ، رج بلطف ، تجنب تكوين الفقاعات) ، جهاز طرد مركزي عند 3,000 × جم لمدة 20 دقيقة تقريبا وصب المحتوى الصافي في أنبوب معقم. Aliquot 200 ميكرولتر في أنابيب التبريد وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  3. أعد تكوين الثرومبين من بلازما الأبقار وفقا لذلك (200 وحدة / مل) ومرشح معقم (مرشح مسام 0.2 ميكرومتر). Aliquot 200 ميكرولتر في أنابيب التبريد وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  4. ل 30 ثقافة إعداد 100 مل من وسط المغذيات (انظر قائمة المواد).
< p class = "jove_title" >3. تشريح أنسجة الحبل الشوكي

ملاحظة: ينتج عن الإجراء ، اعتمادا على عدد الأجنة ، شرائح الحبل الشوكي لحوالي 25-35 ثقافة مشتركة ويتم تحضيرها داخل غطاء تدفق رقائقي في ظل ظروف معقمة.

  1. ضع جرعة قاتلة من البنتوباربيتال (0.4 مل) على الأم عن طريق الحقن العضلي. تأكد من التخدير العميق عن طريق فحص منعكس سحب الدواسة. تسليم أجنة الفئران الجنينية في اليوم 14 (E14) عن طريق الولادة القيصرية والتضحية بقطع الرأس.
  2. انقل أجسام الأجنة إلى طبق بتري مليء بمحلول معقم ومبرد وغسيل.
  3. قم بإجراء قطع عرضي كامل بمشرط فوق الأطراف الخلفية وآخر فوق الأطراف الأمامية وإزالة الأطراف من الجسم. بعد ذلك ، قم بعمل قطع في المستوى الأمامي لفصل الأحشاء عن القطعة الخلفية التي تحتوي على الحبل الشوكي.
  4. للتقطيع ، انقل القطع الخلفية التي تحتوي على الحبل الشوكي واحدة تلو الأخرى على قرص تثبيت وقم بقصها بسمك 225-250 ميكرومتر باستخدام مروحية الأنسجة. ضعي قطرة من محلول الغسيل على المنديل المفروم وانقلي الشرائح بملعقة في أطباق بتري مقاس 35 مم × 10 مم مملوءة بمحلول معقم ومبرد وغسيل.
  5. لكل شريحة على حدة ، قم بتشريح الحبل الشوكي بعيدا عن الأنسجة المتبقية. اترك العقد الجذرية الظهرية متصلة.
  6. دع الشرائح ترتاح لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية.
< p class = "jove_title" >4. تركيب شرائح أنسجة الحبل الشوكي على MEAs

  1. قم بتسخين وسط المغذيات المعقمة في الحاضنة (37 درجة مئوية ، غطاء مفكوك قليلا للأكسجين).
  2. ضع MEA بملاقط معقمة ذات أطراف مغطاة بالمطاط في RT في طبق بتري تحت مجهر استريو مع تركيز مجموعة الأقطاب الكهربائية. ضع قطرة 6 ميكرولتر من بلازما الدجاج في المنتصف على مجموعة الأقطاب الكهربائية النظيفة والخالية من الغبار والمعقمة. باستخدام ملعقة صغيرة ، حرك قسمين من الحبل الشوكي بحذر بحيث يكون الجانبين البطنيين مواجها لبعضهما البعض في قطرة البلازما. لا تلمس الأقطاب الكهربائية باستخدام الملعقة.
  3. أضف 8 ميكرولتر من الثرومبين حول قطرة بلازما الدجاج. باستخدام طرف ماصة الثرومبين ، اخلطي بعناية ووزعي خليط بلازما الدجاج / الثرومبين حول الشريحتين. مرة أخرى ، لا تلمس مجموعة الأقطاب الكهربائية الهشة مباشرة. قبل التخثر مباشرة ، استنشق بلازما الدجاج الزائدة / الثرومبين.
    4. قم
  4. بتغطية طبق بتري للاحتفاظ بالرطوبة العالية بينما يجلس مجموعة MEA / الثقافة لمدة ساعة تقريبا في غرفة رطبة داخل الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
  5. أضف 10 ميكرولتر من وسط المغذيات بحذر إلى غرفة الاستزراع ، وقم بتغطية طبق بتري وأعد إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة تقريبا.
  6. ضع كل مجموعة MEA / Culture بأطراف معقمة مغطاة بالمطاط في أنبوب أسطواني ، أضف 3 مل من وسط المغذيات وأغلق الغطاء بإحكام. ضع أنبوب الأسطوانة في أسطوانة الأسطوانة التي تدور بسرعة 1-2 دورة في الدقيقة في الحاضنة في جو يحتوي على ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية.
  7. قم بتغيير نصف وسط المغذيات بعد 7 أيام في المختبر (DIV) وبعد ذلك 1-2 مرات في الأسبوع.
< p class = "jove_title" >5. الآفات الميكانيكية

  1. خذ مجموعة MEA / الثقافة بأطراف معقمة مغطاة بالمطاط من أنبوب الأسطوانة وضعها في طبق بتري بدون وسط مغذي تحت مجهر استريو مع تركيز الأنسجة في التركيز. تحقق بصريا من اندماج الشريحتين.
  2. حافظ على ثبات مجموعة MEA / الثقافة عن طريق وضع ملاقط ذات أطراف مغطاة بالمطاط على MEA.
  3. ضع شفرة مشرط في أخدود MEA بالقرب من شرائح الأنسجة. امسك المشرط أفقيا إلى حد ما.
  4. ارفع مقبض المشرط لأعلى ولكن اترك شفرة المشرط تبقى في أخدود MEA بطريقة تجعل الشفرة "تتدحرج" من القاعدة إلى الحافة وبالتالي تقطع الأنسجة التي تغطي الأخدود.
  5. شديد أي وصلات نسيجية متبقية بطرف إبرة 25 جم إذا لزم الأمر. اعمل فقط في المنطقة الموجودة داخل الأخدود ولا تلمس حواف العطاء.
  6. ضع مجموعة MEA / الثقافة مرة أخرى في أنبوب الأسطوانة. قدم 3 مل من وسط المغذيات الطازجة للمزارع وضعها مرة أخرى في أسطوانة الأسطوانة في الحاضنة.
< p class = "jove_title" >6. التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية للنشاط التلقائي

  1. للتحقيق في التجديد الوظيفي بين شريحتي الحبل الشوكي بعد العدد المختار من DIV ، قم بتركيب مجموعة MEA / الثقافة في غرفة تسجيل على مجهر وقم بتطبيق حوالي 500 ميكرولتر من محلول خارج الخلية (انظر قائمة المواد).
  2. انتظر 10 دقائق قبل التسجيل الأول للسماح للنظام بالاستقرار.
  3. سجل النشاط التلقائي الأساسي 2x لمدة 10 دقائق تقريبا من كل قطب كهربائي للكشف عن النشاط في MEA في RT.
  4. لضمان ظروف مستقرة خارج الخلية ، قم بتبادل المحلول خارج الخلية بعد كل جلسة تسجيل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1. عرض وتحليل النشاط التلقائي.(أ) رسم تخطيطي لمنطقة متوسطة الأطراف. تم تصوير الأقطاب الكهربائية المغطاة بالبلاتين باللون الأسود ، والأسلاك الشفافة باللون الأحمر والأخدود في منتصف الشرق الأوسط وإفريقيا باللون الأصفر. (ب) لقطة مقربة لمصفوفة الأقطاب الكهربائية الموجودة في وسط منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا. تم توفير الرسوم البيانية من قبل الدكتور م. هيوشكل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مصفوفة مستوية متعددة الأقطاب الكهربائية قواني للعلوم البيولوجية حسب الطلب وفقا لتصميم مختبرنا وسط المغذيات 100 مل عدل Dulbeccos وسيط النسر جيبكو 31966-021 80 مل مصل الحصان جيبكو هاتف: 26050-070 10 مل ماء مقطر ومعقم 10 مل عامل نمو الأعصاب -7S [5ng / mL] سيجما ألدريتش N0513 200 ميكرولتر             معاد تكوينه في محلول غسيل مع 1٪ BSA حل الطلاء جل مصفوفة خارج الخلية BD Biosciences 356230 يجب أن يظل باردا في جميع الأوقات ؛ قم بتخفيف 1:50 مع وسيط محسن للخلايا العصبية قبل الولادة والجنينية وسط محسن للخلايا العصبية قبل الولادة والجنينية جيبكو هاتف: 21103-049 محلول الغسيل [ملغم / لتر] MgCl2-6H 2O 100 MgSO4-7H 2O 100 كيه سي إل 400 ريال KH2PO4 60 كلوريد الصوديوم 8000 ريال Na2HPO4 اللامائي 48 د-جلوكوز (سكر العنب) 1000             وفقا للبروتوكول الخاص http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html محلول خارج الخلية (درجة الحموضة 7.4) [م] كلوريد الصوديوم 145 كيه سي إل 4 مغنكلوريد2 1 كلوريدالهواء 2 2 هيبس 5 Na-pyruvate 2 الجلوكوز 5 بلازما دجاج سيجما ألدريتش P2366 المجفف بالتجميد ، يعيد تشكيله بمحلول الغسيل ماصة دقيقة شركة World Precision Instruments، Inc. MF28G-5 الثرومبين ميرك ميليبور 1123740001 مهيج ، حساس ، إعادة التكوين بمحلول غسيل أنبوب مسطح لزراعة الأنسجة 10 (= أنبوب الأسطوانة) تكنو للمنتجات البلاستيكية AG 91243

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة