توليد عضيات مخيخية ناضجة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات باستخدام المفاعلات الحيوية ذات الاستخدام الواحد

الملخص

المصدر: Silva ، T.P. ، et al. الجيل القابل للتطوير من العضيات المخيخية الناضجة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات وتوصيفها عن طريق التلوين المناعي. J. Vis. Exp. (2020)

< p class = "jove_content">يوضح هذا الفيديو تقنية لتوليد عضيات مخيخية ناضجة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) باستخدام مفاعل حيوي ثلاثي الأبعاد يستخدم مرة واحدة. يسهل المفاعل الحيوي تكوين الركام iPSC, الذي يخضع بعد ذلك للمعالجة بسلسلة من وسائط الاستزراع المخصب في عوامل النمو والكيموكينات التي تحفز تمايز مجاميع iPSC إلى عضيات مخيخية ناضجة. بعد ذلك ، يتم حصاد العضيات وحفظها بالتبريد لمزيد من التحليل.

البروتوكول

ص الفئة = "jove_title" >1. بذر iPSCs البشرية في المفاعل الحيوي

1. احتضان iPSCs المزروعة كطبقات أحادية في mTeSR1 مكملة ب 10 ميكرومتر من مثبطات ROCK Y-27632 (ROCKi). أضف 1 مل من الوسط المكمل إلى كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، و 95٪ رطوبة ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   ملاحظه: يستخدم ROCKi لحماية iPSCs المنفصلة من موت الخلايا المبرمج.
2. بعد 1 ساعة من الحضانة ، قم بشفط الوسط المستهلك من كل بئر وغسل 1x مع 1 مل من 1× PBS لكل بئر.
3. أضف 1 مل من وسط انفصال الخلية (انظر جدول المواد) إلى كل بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق حتى تنفصل الخلايا بسهولة عن الآبار مع الرج اللطيف.
4. ماصة وسط انفصال الخلية لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة دقيقة P1000 حتى تنفصل الخلايا وتنفصل إلى خلايا مفردة. أضف 2 مل من وسط زراعة الخلايا الكامل إلى كل بئر لتعطيل الهضم الأنزيمي وماصة الخلايا برفق في أنبوب مخروطي معقم.
5. جهاز طرد مركزي عند 210 × جم لمدة 3 دقائق وإزالة المادة الطافية.
6. إعادة تعليق الحبيبات الخلية في وسط الاستزراع (بمعنى آخر., mTeSR1 مكمل مع 10 ميكرومتر من ROCKi) وحساب iPSCs مع مقياس الدم باستخدام صبغة التريبان الأزرق.
7. البذور 15 × 10⁶ خلايا مفردة في المفاعل الحيوي (الحجم الأقصى 100 مل) مع 60 مل من mTeSR1 مكملة ب 10 ميكرومتر من ROCKi بكثافة خلية نهائية تبلغ 250,000 خلية / مل.
8. أدخل الوعاء الذي يحتوي على iPSCs في الوحدة الأساسية العالمية الموضوعة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية, 95٪ الرطوبة, و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   ملاحظه: يتم الحفاظ على تحريك المفاعل الحيوي لمدة 24 ساعة عن طريق ضبط التحكم في وحدة القاعدة العالمية على 27 دورة في الدقيقة لتعزيز تجميع iPSC.

< ص الفئة = "jove_title" >2. تمايز ونضج المجاميع البشرية المشتقة من iPSC في العضيات المخيخية

1. حدد يوم البذر أحادي الخلية على أنه اليوم 0.
2. في اليوم 1، اجمع 1 مل من عينة مجاميع iPSC باستخدام ماصة مصلية. حافظ على المفاعل الحيوي تحت التحريض كما كان من قبل عن طريق وضع الوحدة الأساسية العالمية مع المفاعل الحيوي الذي يحتوي على الركام في تدفق معقم قبل جمع العينة. ضع تعليق الخلية في لوحة مرفقة منخفضة للغاية 24 بئرا. تحقق من تكوين المجاميع المشتقة من iPSC.
3. احصل على صور باستخدام مجهر ضوئي باستخدام تكبير إجمالي يبلغ 40x أو 100x لقياس القطر الإجمالي.
4. قم بقياس مساحة الركام في كل صورة باستخدام برنامج FIJI.
   1. حدد "تحليل | اضبط القياسات" من شريط القائمة وانقر على "المنطقة" و "موافق".
   2. حدد "ملف | افتح" من شريط القائمة لفتح ملف صورة مخزن. حدد أداة تحديد الخط المعروضة في شريط الأدوات وقم بإنشاء خط مستقيم فوق شريط المقياس المعروض في الصورة. حدد "تحليل | تعيين المقياس" من شريط القوائم.
   3. في "المسافة المعروفة" ، أضف مساحة شريط مقياس الصورة بالميكرومتر. حدد "وحدة الطول" على أنها ميكرومتر. انقر فوق "عالمي" للحفاظ على الإعدادات و "موافق". حدد تحديد بيضاوي في شريط الأدوات.
   4. لكل ركام ، حدد المنطقة باستخدام الأداة البيضاوية. حدد "تحليل | قياس". احسب قطرها بناء على المساحة المقاسة ، مع الأخذ في الاعتبار أن الركام كروي تقريبا باستخدام
      
      مع A كمساحة الركام.
5. عندما يكون متوسط قطر الركام 100 ميكرومتر ، استبدل 80٪ من الوسط المستهلك ب mTeSR1 طازج بدون ROCKi. عندما يصل قطر الركام إلى 200-250 ميكرومتر ، استبدل كل الوسط المستهلك ب gfCDM (الجدول 1) ، مما يسمح للعضيات بالاستقرار في قاع المفاعل الحيوي.
   ملاحظه: إذا تجاوز متوسط قطر الركام 350 ميكرومتر ، فلا تبدأ بروتوكول التمايز. كرر بذر الخلايا المفردة. بشكل عام ، يستغرق الأمر حوالي يوم واحد حتى يصل متوسط قطر الركام إلى 100 ميكرومتر.
6. أدخل المفاعل الحيوي الذي يحتوي على الركام في الوحدة الأساسية العالمية الموضوعة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، ورطوبة 95٪ ، و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
7. قلل من تحريك المفاعل الحيوي إلى 25 دورة في الدقيقة.
8. في اليوم 2 ، كرر الخطوات 2.2 و 2.3 و 2.4 لتقييم القطر الكلي. أضف 30 ميكرولتر من FGF2 (التركيز النهائي ، 50 نانوغرام / مل) و 60 ميكرولتر من SB431542 (التركيز النهائي ، 10 ميكرومتر) إلى 60 مل من وسط تمايز gfCDM (الجدول 1). يستعاض عن جميع الوسائط المستهلكة من المفاعل الحيوي ب gfCDM المكملة. كرر الخطوة 2.6.
   ملاحظة: SB431542 أمر بالغ الأهمية لتثبيط تمايز الأديم المتوسط ، مما يؤدي إلى التمايز العصبي. يستخدم FGF2 لتعزيز ذيلية الأنسجة الظهارية العصبية.
9. في اليوم 5 ، كرر الخطوات 2.2 و 2.3 و 2.4 و 2.8.
   ملاحظه: يجب أن يزداد الحجم الكلي أثناء بروتوكول التمايز. ومع ذلك ، يكون القطر بالغ الأهمية فقط عندما يبدأ التمايز لأن هذه المعلمة يمكن أن تؤثر على فعالية التمايز.
10. في اليوم 7 ، كرر الخطوات 2.2 و 2.3 و 2.4. تمييع FGF2 و SB431542 إلى 2/3: أضف 20 ميكرولتر من FGF2 و 40 ميكرولتر من SB431542 إلى 60 مل من وسط تمايز gfCDM. يستعاض عن جميع الوسائط المستهلكة من المفاعل الحيوي ب gfCDM المكملة. كرر الخطوة 2.6 وقم بزيادة تحريك المفاعل الحيوي إلى 30 دورة في الدقيقة.
11. في اليوم 14 ، كرر الخطوات 2.2 و 2.3 و 2.4. أضف 60 ميكرولتر من FGF19 (التركيز النهائي ، 100 نانوغرام / مل) إلى 60 مل من وسط تمايز gfCDM. يستعاض عن جميع الوسائط المستهلكة من المفاعل الحيوي ب gfCDM المكمل ب FGF19. كرر الخطوة 2.6.
    ملاحظه: يستخدم FGF19 لتعزيز استقطاب هياكل الدماغ الخلفي.
12. في اليوم 18، كرر الخطوات 2.2 و2.3 و2.4 و2.11.
13. في اليوم 21 ، كرر الخطوات 2.2 و 2.3 و 2.4. استبدل جميع الوسائط المستهلكة من المفاعل الحيوي بوسط عصبي قاعدي كامل (الجدول 1). كرر الخطوة 2.6.
    ملاحظه: الوسط العصبي القاعدي هو وسيط قاعدي يستخدم للحفاظ على عدد الخلايا العصبية داخل العضوية.
14. في اليوم 28، كرر الخطوات 2.2 و2.3 و2.4. أضف 180 ميكرولتر من SDF1 (التركيز النهائي ، 300 نانوغرام / مل) إلى 60 مل من الوسط العصبي القاعدي الكامل. استبدل جميع الوسائط المستهلكة من المفاعل الحيوي بوسط عصبي قاعدي كامل مكمل ب SDF1. كرر الخطوة 2.6.
    ملاحظه: يستخدم SDF1 لتسهيل تنظيم طبقات الخلايا المميزة.
15. في اليوم 35 ، كرر الخطوات 2.2 و 2.3 و 2.4. استبدل جميع الوسائط المستهلكة من المفاعل الحيوي بوسط BrainPhys كامل (الجدول 1). كرر الخطوة 2.6.
    ملاحظه: BrainPhys هو وسيط عصبي يدعم الخلايا العصبية النشطة متشابكيا.
16. استبدل 1/3 من الحجم الكلي كل 3 أيام بوسيط BrainPhys الكامل حتى اليوم 90 من التمايز.

< p class = "jove_content" >الجدول 1: حلول المخزون وإعداد الوسائط. المدرجة هي جميع المكونات والأحجام المستخدمة لإعداد الوسائط لبروتوكول صيانة التمايز والتمايز iPSCs, بالإضافة إلى حلول مخزون عوامل النمو والجزيئات الصغيرة. بالنسبة لحلول المخزون ، يتم سرد جميع تركيزات المخزون وبروتوكولات إعادة التكوين. إعداد الوسائط mTeSR1
الحجم النهائي: 500 مل 1. قم بإذابة مكمل mTeSR1 5× في درجة حرارة الغرفة (RT) أو عند 4 درجات مئوية طوال الليل واخلطه مع المتوسط القاعدي
2. قم بتخزين متوسط mTeSR1 الكامل عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين أو قم بإعداد 40 مل من الكميات وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية
3. قبل تسخين mTeSR1 الكامل في RT قبل الاستخدام gfCDM (وسيط محدد كيميائيا خال من عامل النمو)
الحجم النهائي: 60 مل 30 مل Ham's F12 30 مل IMDM 600 ميكرولتر تركيز دهني محدد كيميائيا (1٪ حجم / حجم) 2.4 ميكرولتر أحادي الجلسرين (450 ميكرومتر) 30 ميكرولتر apo-transferrin (محلول مخزون عند 30 مجم / مل في الماء ، التركيز النهائي: 15 ميكروغرام / مل) 300 مجم BSA منقى بالتبلور (5 مجم / مل) 42 ميكرولتر أنسولين (تركيز المخزون عند 10 مجم / مل ، التركيز النهائي: 7 ميكروغرام / مل) 300 ميكرولتر ف/ثانية (0.5٪ حجم / حجم ، 50 وحدة / مل بنسلين / 50 ميكروغرام / مل ستربتومايسين) Neurobasal
الحجم النهائي: 60 مل 60 مل من المتوسط العصبي 600 ميكرولتر N2 الملحق 600 ميكرولتر Glutamax I 300 ميكرولتر P / S (0.5٪ v / v). أكمل BrainPhys
الحجم النهائي: 60 مل 60 مل من BrainPhys 1.2 مل NeuroCult SM1 المكملات العصبية 600 ميكرولتر N2 الملحق 12 ميكرولتر BDNF (التركيز النهائي: 20 نانوغرام / مل) 12 ميكرولتر GDNF (التركيز النهائي: 20 نانوغرام / مل) 300 ميكرولتر Dibutyryl-cAMP (تركيز المخزون: 100 مجم / مل في الماء ، التركيز النهائي: 1 مل) 42 ميكرولتر حمض الأسكوربيك (تركيز المخزون: 50 ميكروغرام / مل في الماء ، التركيز النهائي: 200 نانومتر) محاليل مخزون لعوامل النمو والجزيئات الصغيرة عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF / FGF2)
تركيز المخزون: 100 ميكروغرام / مل 1. إعادة التكوين في 5 ملي مولار تريس ، درجة الحموضة 7.6 ، بتركيز 10 مجم / مل < br / > 2. تمييع بنسبة 0.1٪ BSA في PBS (v / v) إلى تركيز مخزون نهائي يبلغ 100 ميكروغرام / مل العامل المشتق من الخلايا اللحمية 1 (SDF1)
تركيز المخزون: 100 ميكروغرام / مل 1. إعادة التكوين في الماء بتركيز 10 مجم / مل
2. تمييع بنسبة 0.1٪ BSA (v / v) في PBS إلى تركيز مخزون نهائي يبلغ 100 ميكروغرام / مل. عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF)
تركيز المخزون: 100 ميكروغرام / مل< عامل التغذية العصبية المشتق من الخلايا الدبقية (GDNF)
تركيز المخزون: 100 ميكروغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية 19 (FGF19)
تركيز المخزون: 100 ميكروغرام / مل 1. إعادة التكوين في 5 ملي مولار فوسفات الصوديوم ، درجة الحموضة 7.4 ، بتركيز 10 مجم / مل < br / > 2. تمييع بنسبة 0.1٪ BSA في PBS (v / v) إلى تركيز مخزون نهائي يبلغ 100 ميكروغرام / مل مثبط الصخور Y-27632
تركيز المخزون: 10 ملم إعادة التكوين في DMSO بتركيز 10 ملليمتر. SB431542
تركيز المخزون: 10 ملم الأنسولين
تركيز المخزون: 10 مجم / مل 1. أعد تكوين 10 مجم من الأنسولين في 300 ميكرولتر من 10 ملي هيدروكسيد الصوديوم
2. أضف بعناية 1 M هيدروكسيد الصوديوم حتى يصبح المحلول شفافا
3. املأ حتى 1 مل بالماء المعقم < p class = "jove_content" >الجدول 2: حلول لتحضير العضيات للتقطيع بالتبريد والتلوين المناعي. المدرجة هي جميع المكونات والأحجام المستخدمة لتحضير المحاليل المستخدمة في تحضير العضيات للاستئصال بالتبريد والتلوين المناعي. الجيلاتين / السكروز
التركيز النهائي: 7.5٪ / 15٪ وزن / وزن 1. يزن 15 جم من السكروز و 7.5 جم من الجيلاتين في زجاجة زجاجية معقمة من Schott ويخلط جيدا
2. قم بتسخين PBS 1× مسبقا عند 65 درجة مئوية
3. أضف PBS 1× المسخن مسبقا إلى الوزن النهائي البالغ 100 جم واخلطه جيدا
4. ضع زجاجة Schott الزجاجية في لوح تسخين على حرارة 65 درجة مئوية ورجيها حتى يذوب الجيلاتين
5. احتضان عند 37 درجة مئوية حتى يستقر المحلول

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مجموعة BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 5793 - 500 مل تقنيات الخلايا الجذعية مركز الدهون المحدد كيميائيا 11905031 ثيرموفيشر BSA المنقى بالتبلور 5470 م سيغما DMEM-F12 32500-035 ثيرموفيشر مصل الأبقار الجنينية A3840001 ثيرموفيشر الجيلاتين من جلد البقر جي 9391 سيغما جلوتاماكس الأول 10566-016 ثيرموفيشر ديبوتيريل cAMP SC- 201567 ب -500 مجم فريلابو هام F12 21765029 ثيرموفيشر خط iPSC العرضي البشري أ 18945 ثيرموفيشر آي بي إسك 6.2 IMDM 12440046 ثيرموفيشر إنسولين 91077 ج سيغما آي بي إس DF6-9-9T.B واي سيل إيزو بنتان PHR1661-2 مل سيغما حمض الأسكوربيك أ -92902 سيغما ماتريجيل 354230 كورنينج مصفوفة غشاء القاعدي أحادي الغليسرين م 6154 سيغما إم تي إس 1 85850 -500 مل تقنيات الخلايا الجذعية مكمل N2 17502048 ثيرموفيشر العصبي العصبي 12348017 ثيرموفيشر بارافورمالدهيد 158127 سيغما PBS-0.1 سفينة ذات استخدام واحد رمز المنتج: IA-0.1-D-001 PBS Biotech وحدة قاعدة PBS-MINI MagDrive رمز المنتج: IA-UNI-B-501 PBS Biotech BDNF البشري المؤتلف 450-02 بيبروتك المؤتلف البشري bFGF / FGF2 100-18 ب بيبروتك FGF19 البشري المؤتلف 100-32 بيبروتك GDNF البشري المؤتلف 450-10 بيبروتك SDF1 البشري المؤتلف 300-28 أ بيبروتك مثبط الصخور Y-27632 72302 تقنيات الخلايا الجذعية SB431542 إس 4317 سيغما سكروز إس 7903 سيغما مركب Tissue-Tek O.C.T. هاتف: 25608-930 VWR