عزل الخلايا المناعية المتسللة للورم من دماغ الفئران

الملخص

المصدر: Baker، G.J.، et al.، Lowenstein، P. R. تحليل قياس العزل والتدفق الخلوي لخلايا الدم المحيطية أحادية النواة المتسللة إلى الورم الدبقي. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح الفيديو عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المتسللة إلى الورم من دماغ الفأر باستخدام التفكك الميكانيكي والهضم الأنزيمي. يتبع ذلك الطرد المركزي المتدرج للكثافة لجمع الخلايا المناعية لمزيد من التحليل.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

قم بإعداد محلول خلط وسائط الطرد المركزي الكثافة عن طريق وضع 90 مل من 10x PBS في 264 مل من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء (3.93x) في وعاء بلاستيكي معقم. قم بالمعايرة إلى درجة الحموضة 7.0-7.2 باستخدام حمض الهيدروكلوريك وتعقيم الفلتر من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

< p class = "jove_content" > قم بإعداد وسائط طرد مركزي بكثافة 70٪ من خلال الجمع بين 18 مل من محلول خلط وسائط الطرد المركزي الكثافة مع 30 مل من وسائط الطرد المركزي الكثافة (انظر قائمة المواد للحصول على التفاصيل) في أنبوب طرد مركزي من مادة البولي بروبيلين سعة 50 مل. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية ، لكن يحضره إلى RT قبل الاستخدام.

قم بإعداد وسائط طرد مركزي بكثافة 37٪ عن طريق الجمع بين 9.6 مل من DPBS مع 10.4 مل 70٪ من وسائط الطرد المركزي الكثافة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية ، لكن يحضره إلى RT قبل الاستخدام.

1. عزل PBMCs المتسللة للورم الدبقي

1. باستخدام شفرة حلاقة نظيفة أحادية الحواف ، اعزل منطقة الدماغ التي تحتوي على الورم عن طريق عمل قطع سهمي لمركز الدماغ لتقسيم نصفي الكرة الأرضية. اقلب الجانب الإنسي لنصف الكرة الأرضية المتماثل لأسفل وقم بعمل قطعتين إكليليتيين على مستويات المخيخ والبصلة الشمية لعزل الأنسجة المستهدفة التي تحتوي على غرسة الورم (الشكل 1 أ). يمكن أيضا عزل جزء مكافئ من نصف الكرة المقابل واستخدامه كعنصر تحكم سلبي.
2. ضع الأنسجة المستهدفة في مطحنة الأنسجة الزجاجية المسمى على التوالي والتي تحتوي على 1 مل من DPBS ، وادفع المكبس لأسفل ، وقم بلفه 7 مرات لتعطيل الأنسجة في البداية. ارفع المكبس للسماح للسائل بالاستقرار مرة أخرى في قاع طاحونة الأنسجة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات. ومع ذلك ، قم بلف المكبس 4 مرات فقط خلال التكرارين التاليين و 3 مرات خلال التكرار الأخير لتجنب الإفراط في تكريم الأنسجة.
3. باستخدام ماصة دقيقة P-1000، ضع ثلاثة أحجام بحجم 1 مل من DPBS المثلج بالتتابع على جانبي المكبس لشطفها في طاحونة الأنسجة.
4. أعد تعليق مادة الدماغ الثلاثية عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل ووضعها في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل على الجليد. اشطف جوانب مطحنة المناديل Dounce ب 1 مل إضافي من DPBS المثلج وأضفه إلى نفس أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل. احتفظ بجميع الأنابيب التي تحتوي على مادة دماغية ثلاثية على الجليد حتى تتم معالجة جميع العينات.
5. بمجرد معالجة جميع العينات ، قم بتدوير مادة الدماغ الثلاثية في أنابيب الطرد المركزي سعة 15 مل عند 740 × جم (الحد الأقصى RCF) لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
6. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ومسدس ماصة وأعد تعليق مادة الدماغ المحببة في 1 مل من الإنزيمات الهاضمة المعدة مسبقا باستخدام P-1000. ضع أنابيب الطرد المركزي سعة 15 مل في رف أنبوب الاختبار وضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
7. حرك العينات برفق مرتين طوال فترة الحضانة عن طريق تحريك الأنابيب لتسهيل تفكيك الأنسجة.
8. أضف 6 مل من DPBS المثلج باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل إلى كل أنبوب لتخفيف الإنزيمات الهاضمة. الماصة لأعلى ولأسفل لإعادة التعليق ، وتصفية الأحجام الإجمالية من خلال مرشحات شبكية معقمة من النايلون 70 ميكرومتر إلى أنابيب طرد مركزي جديدة سعة 15 مل على الجليد.
9. قم بتدوير تعليق خلية الدماغ لأسفل عند 740 × جم (الحد الأقصى RCF) لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتحقيق حبيبات أحادية الخلية (الشكل 1 ب). بعد إزالة الأنابيب سعة 15 مل من جهاز الطرد المركزي ، ضعها على الجليد وقم بزيادة درجة الحرارة على جهاز الطرد المركزي إلى حوالي 21 درجة مئوية استعدادا للخطوة التالية.
10. قم بإزالة المادة الطافية بالكامل من كل أنبوب يحتوي على خلايا دماغية وأعد تعليق الكريات في البداية في 1 مل من وسائط الطرد المركزي بكثافة 70٪ باستخدام ماصة دقيقة P-1000. ثم أضف 4 ملليلتر إضافية من وسائط الطرد المركزي بكثافة 70٪ إلى كل أنبوب باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل. قم بربط الأغطية بإحكام وقم بتجانس تعليق الخلية عن طريق التقليب برفق إلى الأنابيب عدة مرات.
11. قم بإزالة أنابيب الطرد المركزي سعة 15 مل التي تحتوي على خلايا الدماغ المعلقة في وسائط الطرد المركزي بكثافة 70٪ من الجليد ، وضعها في رف أنبوب الاختبار في RT. واحدا تلو الآخر، قم بتراكب 2 مل من محلول وسائط الطرد المركزي بكثافة 37٪ بعناية على 5 مل من وسائط الطرد المركزي بكثافة 70٪ باستخدام ماصة دقيقة P-1000 لتشكيل واجهة نظيفة بين طبقتي وسائط الطرد المركزي الكثافة (الشكل 1C).
    1. استخدم علامة ذات رؤوس دقيقة للإشارة إلى موضع الواجهة بحيث يمكن التعرف عليها بسهولة بعد الطرد المركزي عندما يصبح التمييز أقل وضوحا.
12. قم بتدوير أنابيب الطرد المركزي سعة 15 مل عند 740 × جم (الحد الأقصى RCF) لمدة 20 دقيقة عند RT دون انقطاع لتجنب تعطيل الواجهة.
13. بعد الطرد المركزي ، قم بتجميع PBMCs التي تراكمت عند الواجهة بين طبقتي وسائط الطرد المركزي الكثافة (الشكل 1D) عن طريق إدخال ماصة دقيقة P-200 في الأنبوب على طول جانبه ، متجاوزة طبقة الدهون بعناية.
    1. بمجرد وصولك إلى مستوى نطاق PBMC ، استخرج ببطء 200 ميكرولتر من سطح طبقة وسائط الطرد المركزي ذات الكثافة 70٪ وضعها في أنبوب البولي بروبيلين FACS المسمى على الجليد على التوالي. كرر مرة واحدة للحصول على حجم إجمالي يبلغ 400 ميكرولتر لكل عينة.
14. أضف 3 مل من المخزن المؤقت للتدفق إلى كل أنبوب FACS يحتوي على 400 ميكرولتر من PBMCs لتخفيف وسائط الطرد المركزي الكثافة بشكل كاف ، ثم قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 660 × جم (الحد الأقصى RCF) لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: عزل PBMCs المتسللة للورم الدبقي. (أ) استراتيجية لتشريح أنسجة دماغ الفئران التي تحتوي على غرسات الورم الدبقي تقويم العظام في المراحل المبكرة. توضح اللوحة العلوية التقسيم السهمي لنصف الكرة الأرضية المماثل بعيدا عن نصف الكرة المقابل. توضح اللوحة السفلية الجرحين الإكليليين الإضافيين الضروريين لعزل الأنسجة المستهدفة التي تحتوي على غرسة الورم (مظللة باللون الأرجواني). (...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات تعديل Dulbecco للنسور المتوسطة جيبكو هاتف: 12430-054 مع 4.5 جم / لتر D-glucose و L-glutamine و 25 ملي HEPES و فينول أحمر محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco جيبكو 14190-144 بدون كلوريد الكالسيوم أو كلوريد المغنيسيوم مصل الأبقار الجنينية شركة أوميغا العلمية FB-11 البنسلين ستربتومايسين جيبكو 15140-122 10،000 وحدة / مل بنسلين ؛ 10،000 ميكروغرام / مل ستربتومايسين 0.6 مل أنابيب دقيقة مخروطية من مادة البولي بروبيلينيمي جينيسي العلمية 22-272 دلو ثلج من مادة البولي يوريثين فيشربراند 02-591-45 السعة: 0.152 أونصة (4.5 لتر) كولاجيناز (النوع I-S) سيجما ألدريتش [ك1639] من المطثية النسيجية ديوكسيربونوكلياز I شركة ورثينجتون للكيمياء الحيوية LS002007 >2,000 وحدة Kunitz لكل ملغ من الوزن الجاف مقص تشريح كبير شركة تيد بيلا 1316 مقص تشريح صغير FST 14094-11 ملقط نهاية حادة شركة تيد بيلا 13250 [1] 7 مل زجاج Dounce طاحونة الأنسجة كونتس KT885300-0007 وسائط الطرد المركزي الكثافة Percoll جنرال إلكتريك للرعاية الصحية GE17-0891-01 10 مل ماصات مصلية جينيسي العلمية 12-104 استخدام واحد معقم 70μm مصافي خلية شبكة نايلون معقمة فيشربراند 22363548 15 مل أنابيب طرد مركزي من مادة البولي بروبلين جينيسي العلمية 21-103 القاع المخروطي 50 مل أنابيب الطرد المركزي من مادة البولي بروبلين جينيسي العلمية 21-108 القاع المخروطي أنابيب البولي بروبيلين FACS ذات القاع المستدير 12x75mm فيشربراند 14-956-1 ب