إزالة الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل انتقائي من ثقافة الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية للفئران

الملخص

المصدر: Jebelli، J.، et al. الاستنفاد الانتقائي للخلايا الدبقية الصغيرة من مزارع الخلايا الحبيبية المخيخية باستخدام L-leucine methyl ester. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو تقنية للإزالة الانتقائية للخلايا الدبقية الصغيرة من الثقافة العصبية الأولية للفئران. يتم التعامل مع الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية بمضادات المستقلب للقضاء على الخلايا الدبقية المتكاثرة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم معالجتها بعوامل استهداف الليزوزوم لاستنفاد الخلايا الدبقية الصغيرة من الثقافة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الآلات ووسائط الثقافة والأطباق

1. قم بإعداد مقصين لتشريح مختبر الفولاذ المقاوم للصدأ وملقطين مختبريين من الفولاذ المقاوم للصدأ. قم بالتعقيم لجميع الأدوات ووضعها في غطاء ثقافة O / N تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (UV) للتعقيم.
2. اصنع 500 مل من الحد الأدنى من وسط زراعة الوسائط الأساسية (10٪ مصل بقري للجنين [FBS] ، 20 ملي كلوريد الجنين ، 25 ملي هيدروكلوريد الصوديوم₃ ، 30 ملي مولار د-جلوكوز ، 2 ملي لتر جلوتامين ، 100 وحدة / مل بنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين و 6 ميكروغرام / مل أمبيسلين) وتعقيم الفلتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لعدة أشهر.
3. قم بإعداد 24 لوح استزراع بئر يحتوي على أغطية بسمك 14 مم ، رقم 1. الأوتوكلاف الغطاء وقم بتغطيته في 100 ملغم/لتر بولي د-ليسين (PDL). ضوء الأشعة فوق البنفسجية تعقيم O / N.

< p class = "jove_title" >2. تحضير محاليل زراعة الخلايا الحبيبية المخيخية (CGC)

1. تحضير "محلول أ" (100 مل) في محمية ، معالج بالأشعة فوق البنفسجية ، معقم dH₂O يحتوي على 250 مجم من الجلوكوز ، و 300 مجم من ألبومين مصل الأبقار [BSA] ، و 955 مجم من محلول ملحي مخزن بالفوسفات [PBS] (خالي من Ca²⁺ و Mg ⁺) ، و 1 مل من 3.8٪ MgSO₄ ·7H₂O.
2. تحضير "محلول ب" (10 مل) يحتوي على 1 مل من 5 ملغ/ مل من التربسين المخفف في 9 مل من المحلول أ.
3. تحضير "محلول C" (10 مل) يحتوي على 1,000 وحدة DNase ، 0.5 مجم من مثبط التربسين لفول الصويا ، 100 ميكرولتر من 3.8٪ MgSO₄ ·7H₂O ، مخفف إلى 10 مل مع محلول A.
4. تحضير "محلول D" (20 مل) يحتوي على 3.2 مل من المحلول C ، مخفف إلى 20 مل بالمحلول A.
5. تحضير محلول الملح المتوازن BSA / Earle (EBSS) الذي يحتوي على EBSS و 25 ملي مولار NaHCO₃ و 3 ملي مولار MgSO₄ ·7H₂O و 4٪ BSA ، درجة الحموضة 7.4.
6. قم بإعداد L-leucine Methyl Ester (LME) عن طريق إضافة LME النقي إلى 5 مل من وسط زراعة MEM لإعطاء تركيز نهائي يبلغ 150 ملي مولار LME ، وإعادة المحلول إلى درجة الحموضة 7.4 باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني على الطاولة ، وتعقيم الترشيح باستخدام مرشح حقنة بولي إيثر سلفون 28 مم (PES) 0.2 ميكرومتر.

< p class = "jove_title" >3. ثقافة CGCs

1. اجمع المخيخ من صغار الفئران البالغة من العمر 4-7 أيام. ضعها على الفور في طبق بتري يحتوي على 5 مل من محلول A على الثلج.
2. اسكب المحلول الزائد من المخيخ وضع الأنسجة في غطاء طبق بتري.
3. اقطع الأنسجة جيدا بشفرة حلاقة ملتهبة جيدا في ثلاثة اتجاهات مختلفة على الأقل.
4. أضف الأنسجة المفرومة إلى المحلول B (اشطف طبق بتري بمحلول لضمان فقد أنسجة محدودة) وضعها في الحمام المائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
5. أضف المحلول D (20 مل) إلى الأنبوب لتحييد التربسين ، ورجه وجهاز الطرد المركزي عند 65 × جم لمدة 5 دقائق.
6. اسكب المادة الطافية.
7. أعد تعليقها في 4 مل من المحلول C. ثلاثي البئر (حوالي 10 مرات لكل منهما) بثلاث ماصات زجاجية ملتهبة ذات قطر متناقص ، حتى يصبح التعليق متجانسا قدر الإمكان.
8. أضف بضع قطرات من هذا التجانس ببطء وبرفق فوق BSA / EBSS. إذا بدأ في الغرق من خلال BSA / EBSS ، فقم بترتيتوري أكثر و / أو أضف المزيد من الحل C. يجب أن يجلس المتجانس في طبقة أعلى BSA / EBSS. لا تهز. تدور في 100 × جم لمدة 5 دقائق.
9. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات (الناعمة) في 1 مل من وسط MEM.
10. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم واللوحة عند 800,000 خلية / غطاء في 500 ميكرولتر من وسط MEM. ضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 6٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
11. قم بتغيير الوسيط في اليوم التالي (24-36 ساعة بعد التحضير). اصنع محلولا من وسط MEM يحتوي على 10 ميكرومتر من مثبط دورة الخلية أرابينوفيرانوسيل سيتيدين (AraC).
    1. لكل غطاء ، احتفظ ب 250 ميكرولتر من الوسط القديم في طبق جديد مكون من 24 بئرا ، واستنشق الباقي ، وأضف 250 ميكرولتر من وسط MEM العادي ، واستنشطه لغسل الخلايا. بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولتر من الوسط القديم مرة أخرى إلى الخلايا وقم بتعبئة 250 ميكرولتر من الوسط المحتوي على AraC.
       ملاحظه: يمكن استخدام الخلايا من 6 أيام في المختبر (DIV).

< p class = "jove_title" >4. استنفاد الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل انتقائي (يتم إجراؤه عند 6 DIV)

1. أضف LME النقي إلى 5 مل من كمية منفصلة من وسط MEM لإعطاء تركيز نهائي يبلغ 150 ملي مولار من LME.
2. أعد المحلول إلى درجة الحموضة 7.4 وقم بتعقيم الفلتر باستخدام مرشح حقنة بولي إيثر سلفون (PES) 28 مم (PES) 0.2 ميكرومتر.
3. يخفف المحلول بتركيز 50 ملي مولار (2 × LME) في وسط MEM ويوضع في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق جنبا إلى جنب مع وسط MEM العادي لثقافات التحكم.
4. قم بإزالة نصف (250 ميكرولتر) من وسط MEM من مزارع CGC واحتفظ بها عند 37 درجة مئوية.
5. عالج الخلايا بوسط MEM يحتوي على 2 × LME (250 ميكرولتر) ، أي مخفف 1: 1 يعطي تركيز جيد يبلغ 25 ملي مولار ، أو بوسط MEM مسخن مسبقا بدون LME (250 ميكرولتر) لثقافات التحكم.
6. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 6٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة ساعة واحدة.
7. اغسل الخلايا مرتين في وسط MEM جديد ودافئ مسبقا لإزالة الوسائط المحتوية على LME ، ثم استبدل وسط الاستزراع المحتفظ به وحجم متساو من وسط MEM الطازج الدافئ مسبقا بالآبار المقابلة.
8. إعادة المستزرعات إلى الحاضنة (مرطبة بنسبة 6٪ ثاني أكسيد الكربون_عند 37 درجة مئوية) واتركها للراحة لمدة 24 ساعة قبل أي علاج آخر.

المواد