إنشاء ثقافة ثلاثية الأبعاد للخلايا الدبقية المشتقة من دماغ الفئران

الملخص

المصدر: Koss ، K. M ، et al. ثقافات هيدروجيل ثلاثية الأبعاد محسنة للخلايا الدبقية الأولية للنمذجة في المختبر للالتهاب العصبي. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو تقنية لإنشاء ثقافة ثلاثية الأبعاد للخلايا الدبقية. يتم تغليف الخلايا الدبقية المشتقة من دماغ الفئران داخل مصفوفة بوليمر قابلة للتشابك الضوئي تحتوي على مكونات مصفوفة خارج الخلية. عند الحضانة في وسط النمو ، تتكاثر الخلايا الدبقية داخل المصفوفة الداعمة لإنشاء ثقافة ثلاثية الأبعاد.

البروتوكول

تمت الموافقة على بروتوكول استخراج أنسجة المخ من اليوم الأول من صغار الفئران Sprague Dawley ، التي تم قتلها رحيما بقطع الرأس ، من قبل لجنة رعاية واستخدامه في جامعة ألبرتا.

< p class = "jove_title" >1. الخلايا الدبقية الصغيرة وعزل الخلايا النجمية

ملاحظة: يتم تسخين جميع وسائط العزل وزراعة الخلايا مسبقا إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. يحتوي محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) على 1٪ بنسلين ستربتومايسين (PS). تستكمل جميع وسائط النسر المعدلة من Dulbecco مع خليط المغذيات Ham's F12 (DMEM / F12) بنسبة 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين ستربتومايسين (PS). فقط الخلطات مع التربسين تفتقر إلى FBS. جميع المواد في هذا البروتوكول معقمة (مرشح ، كحول ، مشترى ، ومعتم) ويتم تنفيذ كل خطوة تلي الخطوة رقم 1.8 في خزانة السلامة البيولوجية بتقنية معقمة.

1. لكل دماغ ، قم بتسخين 15 مل من HBSS و 12.5 مل DMEM / F12 إلى 37 درجة مئوية في أنابيب الطرد المركزي المخروطية سعة 50 مل ، وحوالي 2 مل من 0.25٪ تريبسين مع 1 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل. سخني 25 مل إضافي من DMEM / F12. قم بتسخين التربسين قبل حوالي 10 دقائق من الاستخدام لمنع فقدان النشاط الأنزيمي.
2. صب ما يكفي من HBSS الدافئ في أطباق مزرعة معقمة مقاس 6 و 10 سم لتغطية السطح. قم بإعداد طبق واحد بحجم 10 سم لكل دماغين بالإضافة إلى طبق إضافي بطول 6 سم.
3. ضع ما يصل إلى 2 دماغ في كل طبق 10 سم² (الشكل 1 أ).
4. تحت مجهر التشريح ، استخدم ملقطا منحنيا ومستقيما لفصل القشرة على طول خط الوسط والمخيخ مع جذع الدماغ. ينتج عن هذا ثلاثة أقسام من الأنسجة لكل دماغ (الشكل 1 ب).
5. قشر الطبقة الرقيقة شبه الشفافة (السحايا) من الأنسجة التي تحتوي على الأوعية الدموية من كل قسم من الأنسجة وتخلص منها ، وانقل الأنسجة المتبقية إلى طبق استزراع منفصل. أمسك الطبقات الرقيقة المكشوفة من جروح الأنسجة ، باستخدام الملقط ، واسحب بحذر حتى "تتدلى" أجزاء كبيرة من أنسجة المخ. أخيرا ، قم بإزالة هذا الجزء عن طريق السحب برفق. انظر الشكل 1C-1E للحصول على صور تمثيلية قبل هذه الخطوة وأثناءها وبعدها.
6. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بإزالة HBSS المتبقي من طبق الثقافة ، مع الاحتفاظ بالأنسجة بعناية. نقع الأنسجة بمشرط ونقل الأنسجة إلى أنبوب 15 مل الدافئ مسبقا مع التربسين.
7. احتضان هذا الأنبوب لمدة 25 دقيقة في حمام 37 درجة مئوية لهضم الأنسجة إنزيميا.
قم
8. بالطرد المركزي للأنبوب عند 500 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، واسكب المادة الطافية.
9. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، أضف 10 مل من DMEM / F12 الدافئ لتعطيل التربسين وثلاثية المحلول 5 مرات لتفتيت الأنسجة.
قم
10. بالطرد المركزي للأنبوب عند 500 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، واسكب المادة الطافية.
11. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل، أعد تعليق الحبيبات إلى 10 مل من DMEM/F12 الدافئ وانقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل.
12. باستخدام حقنة سعة 10 مل بإبرة قياس 18 ، قم بتقطيع المحلول 3 مرات.
13. وزع هذا المحلول على زيادات قدرها 12.5 مل من DMEM/F12 الدافئ لكل دماغ.
14. زيادات الماصة 1 مل من المحلول الثلاثي إلى صفيحة 12 بئر (1 لكل دماغ).
15. تحتضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة. استبدل الوسائط بعد ثلاثة أيام، وقم بتحديث الوسائط كل ثلاثة أيام لاحقة. بعد أسبوعين ، يمكن جمع الخلايا للتجارب.

< p class = "jove_title" >2. توليف ماكرومر

1. يزن 375 مجم من ملح حمض الهيالورونيك (HA) في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل وأضف 37.5 مل من الماء المقطر.
2. اغسل المحلول بدوامة لمدة 1 دقيقة وقم بصوتنة الخليط حتى يبدو متجانسا ويفقد لزوجته الشبيهة بالهلام. قد تستغرق هذه العملية 6 ساعات.
3. انقل المحلول إلى دورق سعة 100 مل باستخدام قضيب تقليب مغناطيسي (38 مم) ، وحرك بقوة في درجة حرارة الغرفة.
4. قم بمعايرة 5.0 M هيدروكسيد الصوديوم بعناية في حمض الهيدروكسيد الخلط وقم بالقياس بورق الأس الهيدروجيني حتى يستقر الرقم الهيدروجيني بين 8 و 12.
5. اجمع 3 مل من أنهيدريد الميثاكريليك الطازج (MA ، 94٪) ، مغطى بالنيتروجين أثناء التخزين.
   ملاحظه: يتعرض MA للغلاف الجوي لفترات طويلة (أيام) ، وسوف يفقد تفاعله.
   أنذر: يجب أن يتم كل استخدام MA في غطاء الدخان.
6. أضف 200 ميكرولتر من MA إلى محلول HA. يخفض التفاعل درجة الحموضة للمحلول إلى أقل من 8.
7. كرر الخطوات من 2.4 إلى 2.6 حتى تتم إضافة 3 مل من MA إلى المحلول. قد تستغرق هذه العملية ما يصل إلى 1-2 ساعة.
8. اترك التفاعل يستمر طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، دون خلط.
9. انقل المحلول إلى 400 مل من الإيثانول البارد (EtOH) في دورق سعة 500 مل واسمح بهطول الأمطار لمدة 24-72 ساعة عند 4 درجات مئوية.
10. صب الجزء الأكبر من المحلول بعناية في دورق منفصل للتخلص منه ، واجمع الراسب في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل. يمكن توزيع هذا في 2-4 أنابيب ، إذا لزم الأمر.
11. الطرد المركزي الأنابيب عند 200 × جم في جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة والتخلص من المادة الطافية.
12. قم بتعبئة الأنبوب باستخدام EtOH البارد ، واخلط المحلول مع دوامة لمدة دقيقة واحدة ، وكرر الخطوة 2.10-2.11.
13. أضف 25 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات ، واخلط المحلول مع دوامة لمدة 1 دقيقة ، وصوتنة (>20 كيلو هرتز) لمدة ساعة واحدة ، واحتضانها عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
14. ضع المحلول في فريزر -80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أو حتى يتجمد أو يتجمد فلاش في النيتروجين السائل.
    أنذر: عند استخدام النيتروجين السائل ، استخدم قفازات واقية وواقي للوجه ومئزر.
15. جفف الأنبوب بالتجميد (أقل من 0.1 ملي بار و -30 درجة مئوية) لمدة 24-48 ساعة حتى يتم إنتاج مسحوق يشبه الثلج.
16. في هذه المرحلة ، اختبر العينة للتأكد من نقائها عبر الرنين المغناطيسي النووي ¹H ، حيث يمكن تأكيد كمية بروتونات الميثاكريلات (ذروتها عند 6.1 و 5.6 جزء في المليون) ، بالنسبة لبروتونات الميثيل (1.9 جزء في المليون) ، على العمود الفقري ل HA. الحد الأدنى من نسبة الميثاكريلات إلى بروتونات الميثيل مقبول.

فئة < ص = "jove_title" >3. تشكيل هلام وتغليف 3D

1. الغطاء وإعداد القالب
   1. اصنع محلول ماء مقطر سعة 50 مل من 2٪ 3- (Trimethoxysilyl) بروبيل ميثاكريلات في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل.
   2. ضع أغطية زجاجية مقاس 18 مم في محلول وصخور لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. يمكن إضافة ما يصل إلى 50 غطاء في وقت واحد.
   3. اشطف الغطاء عن طريق غمس كل منها بشكل متسلسل في 3 أكواب سعة 100 مل من الماء منزوع الأيونات.
   4. جفف الأغطية في فراغ عند 40 درجة مئوية طوال الليل باستخدام مجفف وفرن.
   5. اغمر الأغطية الفردية بسرعة في 70٪ EtOH باستخدام ملقط.
   6. بدون تجفيف ، قم بإسقاط كل غطاء في بئر من 12 بئر.
   7. اغسل كل بئر وشفطه بالماء المعقم منزوع الأيونات (1 مل لكل بئر).
   8. أضف 1 مل من 2 ميكروغرام / مل معقم بولي إل ليسين (PLL) إلى كل بئر واحتضنه لمدة >2 ساعة.
   9. قم بسحب محلول PLL والسماح للأغطية بالجفاف في الهواء.
   10. اغمر قوالب بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) (انظر الشكل 2) في 70٪ EtOH ، وضع واحدة في وسط كل غطاء ، واتركها تجف في الهواء وقم بإنشاء ختم بين القالب والزجاج.
       1. قم بإعداد قوالب PDMS عن طريق صب كواشف خلطة PDMS بنسبة 10: 1 في طبق بوليسترين مسطح القاع. يتم تحديد كمية PDMS المحضرة لإنتاج ورقة بسمك 1 مم تقريبا. لتشكيل آبار في PDMS ، قم بقص الأوراق بكمة دائرية بقطر داخلي 10.
2. تحضير الخلية
   ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات البروتوكول بتقنية معقمة في خزانة السلامة البيولوجية. يتم ضبط محلول المحلول الملحي المخزنة بالفوسفات (PBS) إلى درجة الحموضة 7.4 لجميع الخطوات.
   1. قبل 24 ساعة من تغليف الخلايا في حمض الهيالورونيك الميثاكريليت (HAMA) ، قم بتحديث الوسط للثقافات الأولية لمدة أسبوعين (من الخطوة 1.15) في 12 لوحة بئر. أضف 1 مل من DMEM / F12 (10٪ FBS و 1٪ PS) متوسطة لكل بئر.
   2. لكل صفيحة من الخلايا المكونة من 12 بئرا ، قم بإعداد 12.5 مل من التربسين المخفف (0.25٪ تريبسين-EDTA مخفف بنسبة 30٪ بوسائط DMEM / F12) ، و 25 مل DMEM / F12 (10٪ FBS و 1٪ PS) وقم بتسخينه عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
   3. اجمع الوسط المكيف من الألواح باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل (> 0.5 مل لكل بئر) ، واستنشق السائل المتبقي جيدا ، واستبدله ب 1 مل لكل بئر من التربسين المخفف (0.075٪ حمض التربسين - إيثيلين ديامين تترا أسيتيك [EDTA]) لمدة 20-30 دقيقة في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) حتى تنفصل طبقة الخلية المتقاربة عن اللوحة.
   4. استرجع مادة الخلية العالقة باستخدام ماصة سعة 1 مل (تظهر كقطعة عائمة واحدة) وقم بتجميعها في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل. خفف بحجم مكافئ من DMEM / F12 (10٪ FBS و 1٪ PS) ، وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، مع التخلص من المادة الطافية.
   5. أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل DMEM / F12 دافئ (10٪ FBS و 1٪ PS) ، وقم بترتيبات الخلايا 5 مرات باستخدام ماصة 10 مل ، وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة دقيقتين.
   6. صب المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 5 مل دافئ DMEM / F12 ، وانقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل.
   7. باستخدام حقنة سعة 10 مل بإبرة قياس 18 ، قم بترتيتر محلول الخلية 3 مرات ، وقم بتصفية التعليق من خلال غربال خلية 40 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي مخروطي جديد.
   8. اجمع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية ، وقم بتخفيف 1: 100 في DMEM / F12 الدافئ ، وعد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي.
   9. احتضن في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى خطوة التغليف.
تغليف
3. الخلية
   ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات البروتوكول بتقنية معقمة في خزانة السلامة البيولوجية.
   1. لكل صفيحة مكونة من 12 بئرا من الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد ، قم بتسخين 12.5 مل من DMEM / F12 و 12.5 مل من وسائط DMEM / F12 المكيفة التي تم جمعها أثناء تحضير الخلية.
   2. قم بوزن كمية HAMA المطلوبة للتركيز النهائي 0.5٪ بالوزن / الحجم ، قم بإذابة HAMA في PBS مفلتر معقم بتركيز (2٪ بالوزن / حجم) ؛ يتم استخدام تركيز أعلى 4 مرات من التركيز النهائي لاستيعاب إضافة الخلايا والكواشف الأخرى. تتطلب لوحة واحدة من الهلاميات المائية 12 بئرا ~ 350 ميكرولتر PBS مع 7 مجم HAMA.
   3. محاليل Sonicate (>20 كيلو هرتز) حتى يتم إذابة HAMA بالكامل لمدة 60 دقيقة.
   4. قم بإعداد محاليل فردية بنسبة 10٪ من كل من ثلاثي إيثانول أمين (TEA) و 1-فينيل -2-بيروليدينون (NVP) ، ومحلول 1 ملي مولار من Eosin Y (EY) في 1 مل من الأس الهيدروجيني المعقم PBS 7.4.
   5. بالنسبة للوحة واحدة مكونة من 12 بئرا ، اصنع خليطا نهائيا بسعة 1.4 مل من 1 × 10⁷ خلايا ، و 0.5٪ بالوزن / حجم HAMA (350 ميكرولتر من 2٪ بالوزن / حجم) ، و 0.1٪ TEA (14 ميكرولتر من 10٪) ، و 0.1٪ NVP (14 ميكرولتر من 10٪) ، و 0.01 ملي مولار EY (14 ميكرولتر من 1 ملليمتر) ، و 20٪ خليط الصفيحة القاعدية (280 ميكرولتر من المخزون). الحجم المتبقي هو PBS.
   6. امزج المحلول برفق وماصة 100 ميكرولتر في كل قالب PDMS بطرف 1 مل.
   7. قم بتعريض العينات لضوء LED أخضر عالي الكثافة (~ 520 نانومتر ، 60 ميجاوات ، في صندوق مغلق مقاس 20 سم × 20 سم × 20 سم) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   8. أضف 1 مل لكل بئر من DMEM / F12 المكيف الدافئ إلى طبق 12 بئر.
   9. أمسك كل غطاء بين الإبهام والسبابة ، وقم بتقشير قالب PDMS ببطء باستخدام ملاقط منحنية مع الحرص على عدم إزاحة الجل ووضعه في بئر بوسط مكيف.
   10. أضف 1 مل إضافي من DMEM / F12 دافئ إلى كل بئر.
   11. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة أسبوعين ، وقم بتحديث الوسائط الخلوية كل أسبوع عن طريق سحب 1 مل من الوسائط من كل بئر واستبدالها ب 1 مل DMEM / F12.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تشريح اليوم 1 دماغ جرو الفئران Sprague Dawley.صور للدماغ كله (A) ، وتشريح القشرة والمخيخ (B) ، وقشرة واحدة مع السحايا (C) ، وتقشير السحايا بالملقط (D) ، والقشرة الخالية من السحايا (E).

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1. مواد لتخليق HAMA والبلمرة الضوئية حمض الهيالورونيك (HA) سيجما ألدريتش 53747-10 جرام العقدية معادلة ، ميغاواط: 1.5 - 1.8 × 10 ^ 6 أنهيدريد الميثاكريليك (MA) سيجما ألدريتش 275585-100 مل هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) سيجما ألدريتش 221465-25 جرام الإيثانول (EtOH) شركة الكحول التجارية اللامائي أقراص محلول ملحي مخزن بالفوسفات (درجة الحموضة 7.4) فيشر ساينتيك 18912014 ثلاثي إيثانول أمين (شاي) سيجما ألدريتش 90279-100 مل 1-فينيل -2بيروليدينون (NVP) سيجما ألدريتش V3409-5G EosinY (EY) سيجما ألدريتش E6003-25G Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 مجموعة المطاط الصناعي المصنوعة من السيليكون داو كورنينج 3- (تريميثوكسي سيليل) بروبيل ميثاكريلات سيجما ألدريتش 440159-100 مل دورق (100 مل) كورنينج 1000-100 دورق (500 مل) كورنينج 1000-600 ورق الأس الهيدروجيني (Labstick) سيجما ألدريتش 9580 2. مواد لعزل الخلايا الدبقية وزراعة الخلايا P1-2 صغار الفئران سبراج داولي نهر تشارلز CD Sprague Dawley رمز سلالة الفئران 001 مقص التشريح - شفرات رفيعة (صغيرة) أدوات العلوم الدقيقة 14081-09 مقص جراحي - Toughcut (كبير) أدوات العلوم الدقيقة 14130-17 ملقط ناعم (دومون # 5) أدوات العلوم الدقيقة 11521-10 ملقط ناعم منحني (Dumont # 7) أدوات العلوم الدقيقة 11271-30 محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) جيبكو 14170-112 وسط النسر المعدل من Dulbecco ومزيج مغذيات لحم الخنزير F-12 (DMEM / F12) جيبكو هاتف: 11320-033 البنسلين الستربتومايسين (PS) جيبكو 15140-122 مصل الأبقار الجنينية (FBS) جيبكو هاتف: 12483-020 0.25٪ حمض التريبسين إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) جيبكو هاتف: 25200-072 بولي إل ليسين (PLL) سيجما ألدريتش ف -6282 أنبوب الطرد المركزي المخروطي 50 مل فيشر ساينتيك 05-539-13 أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل 15 مل فيشر ساينتيك 05-539-5 12 بئر ألواح معالجة لزراعة الأنسجة (Cellstar) غرينر بيو ون 665 108 ماصة مصلية سعة 10 مل فيشر ساينتيك 13-676-10F 25 مل ماصة مصلية فيشر ساينتيك 12-676-10 ك طبق بتري (60 مم × 15 مم) فيشر ساينتيك FB0875713A طبق بتري (100 مم × 15 مم) فيشر ساينتيك FB0875712 غطاء مجهر (18 مم) فيشر ساينتيك 12-545-100 18CIR