$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. زراعة الخلايا وإعداد الكاشف
- تحضير الألواح المطلية لزراعة الخلايا.
قم - بتخفيف محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية (ECM) بوسائط DMEM / F12 لتحضير محلول مخزون 1 مجم / مل. قم بتخزين محلول مخزون ECM المخفف في 30 أنبوبا مخروطيا سعة كل منها 3 مل وخزنها على الفور في -20 درجة مئوية. للحصول على حل عملي، أعد تعليق 3 مل من مخزون ECM إلى 33 مل من وسائط DMEM/F12 المبردة مسبقا، ليصل الحجم الإجمالي إلى 36 مل بتركيز 80 ميكروغرام/مل.
- قم بتغطية 1 مل لكل بئر من لوحة زراعة الخلايا المكونة من 6 آبار باستخدام محلول عمل ECM. أضف 1 مل إضافي من DMEM / F12 لكل بئر (إذا لزم الأمر) لضمان تغطية سطح البئر بالكامل. اسمح لألواح زراعة الخلايا المطلية المكونة من 6 آبار بالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل الاستخدام.
ملاحظة: يمكن تخزين الألواح المطلية في الحاضنة أو عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
- تحضير تركيبات الوسائط وعوامل النمو والجزيئات الصغيرة.
- لتحضير 500 مل من وسط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) ، أضف مكملات 20x و 500x وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
- لتحضير 500 مل من الوسط العصبي (NM) ، أضف الهيبارين إلى التركيز النهائي البالغ 2 مجم / مل ، أو 1x من محلول المضادات الحيوية / مضادات الفطريات ، أو 1x B27 أو 1x N2 مكمل إلى زجاجة 500 مل من DMEM / F12 مع مكمل L-glutamine كما هو مفصل سابقا.
- لتحضير محلول مخزون 10 ملي مولار (1,000 ضعف) من مثبط رو-كيناز Y27632 (Y) ، أضف 10 مجم من المسحوق إلى 3 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). قم بالتصفية والتعقيم والتخزين عند -20 درجة مئوية. استخدم بتركيز عمل 10 ميكرومتر في الوسائط.
- لتحضير محلول مخزون 20 ملي مولار (10,000 ضعف) من SB431542 ، أضف 10 مجم من المسحوق إلى 1.3 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). لتحضير محلول مخزون 2 ملي مولار (1,000 ضعف) من DMH1 ، أضف 10 مجم من المسحوق إلى 13.1 مل من DMSO. قم بتصفية كل محلول وتعقيمه وتخزينه عند -20 درجة مئوية. استخدم كل منها بتركيز عمل 2 ميكرومتر في الوسائط (NM + SB431542 + DMH1).
ملاحظه: يوصي هذا البروتوكول بتركيزات عمل 2 ميكرومتر لكل من SB431542 و DMH1 بناء على ملاحظاتنا وتقارير من الآخرين تفيد بأن هذا التركيز يعزز بشكل فعال الحث العصبي من hPSCs. كما تم الإبلاغ عن تركيزات أعلى30. بالإضافة إلى ذلك ، مع الوسائط البديلة ، فقد ثبت أيضا أن الجزيئات الصغيرة ليست ضرورية للتحويل العصبي العالي. وبالتالي ، ستختلف تركيزات العمل اعتمادا على بيئات زراعة الخلايا البديلة ، ويجب اختبار التركيزات المثلى من قبل الباحثين الأفراد.
- لتحضير 100 ميكروغرام / مل (10،000x) من محلول المخزون الفردي لعامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية -2 (FGF2) ، أضف 1 مجم من كل منهما إلى 10 مل من PBS + 0.1٪ BSA. Aliquot EGF و FGF2 محاليل مخزون في 50 ميكرولتر وتخزينها عند -80 درجة مئوية. على سبيل المثال ، أضف 5 ميكرولتر EGF و 5 ميكرولتر FGF2 إلى 50 مل من NM (NM + EGF + FGF2).
- لتحضير محلول مخزون من دوكسيسيكلين هيدروكلوريد (Dox) ، قم أولا بإذابة المسحوق في DMSO إلى 100 مجم / مل وتخزينه في -20 درجة مئوية. علاوة على ذلك ، قم بتخفيفه لعمل محلول مخزون 2 مجم / مل (1,000 ضعف) في PBS وتخزينه عند -20 درجة مئوية. على سبيل المثال ، أضف 50 ميكرولتر دوكس إلى 50 مل من NM (NM + Dox).
ملاحظه: لا تقم بإعادة تجميد المحاليل بعد الذوبان.
< p class = "jove_title" >
2. توليد الأنواع الفرعية العصبية من الخلايا متعددة القدرات المستحثة البشرية (hPSCs)
ملاحظة: يجب الحفاظ على جميع مزارع الخلايا في حاضنة بها 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية. يتم الحفاظ على هذه الثقافات عند مستويات الأكسجين في الغرفة ، على الرغم من أنه يمكن استخدام مستويات أقل.
- إنشاء وصيانة أسلاف الخلايا النجمية (hAstros) من hPSCs.
ملاحظه: يوفر هذا القسم بروتوكول تمايز موجزا ومبسطا. للحصول على وصف مفصل (مع تكوين الجسم الجنيني ، واختيار الوردة ، وخطوات الزخرفة الإقليمية) ، راجع البروتوكول الموصوف سابقا (الشكل 1 أ ، المربع الأخضر المنقط).
- مجموعات بذور hPSCs (الشكل 1 ب) على ألواح 6 آبار مطلية ب ECM (انظر الخطوة 1.1) مع 2 مل من متوسط hPSC + Y لكل بئر. قم بتغذية الخلايا الجذعية كل يوم حتى تتلاقى حوالي 50٪ وتنقسم حسب الحاجة.
- لتقسيم hPSCs ، أضف 1 مل من الكاشف المقطع إلى الآبار والشفق بعد 1 دقيقة. احتضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، وأضف 1 مل من وسط hPSC ، وقم بتقسيم الركام 1:10 على آبار جديدة مطلية ب ECM في 2 مل من متوسط hPSC + Y لكل بئر.
- حافظ على الخلايا الجذعية حتى تتلاقى حوالي 50٪ ، ثم قم بتغيير الوسائط إلى NM + SB431542 + DMH1 للحث على التمايز العصبي (اليوم 0). عندما تكون الخلايا ملتصقة بنسبة 95٪ ، قم بتقسيم 1: 6 إلى آبار جديدة مغلفة ب ECM في نفس الوسط.
- في اليوم 14 ، قم بفصل الخلايا بمحلول الانفصال وانقلها إلى قارورة غير مطلية ب Y لتعزيز تكوين الركام.
ملاحظه: يتم استخدام إضافة Y لتعزيز بقاء الخلايا وتكوين الكرة ولكن لا يتم تضمينها أثناء كل تغذية.
- لتوليد الأسلاف العصبية والخلايا العصبية (hNeurons) ، استخدم خلايا اليوم 14 هذه كما هو موضح أدناه. بدلا من ذلك ، استخدم هذه الخلايا في نقاط زمنية لاحقة من الثقافات أحادية الطبقة أو الكرة قبل حدوث نضوج الخلايا العصبية أو بدء تكوين الخلايا الدبقية.
ملاحظه: بشكل افتراضي ، ينتج هذا البروتوكول الخلايا النجمية الظهرية القشرية. ومع ذلك ، يمكن تحديد الأنواع الفرعية للخلايا النجمية إقليميا عن طريق إضافة مورفوجينات الزخرفة إذا رغبت في ذلك. يمكن إضافة حمض الريتينويك (RA) لذيلية الخلايا إلى أنماط ظاهرية للحبل الشوكي ، في حين أن القنفذ الصوتي (SHH) أو ناهض الأملس (SAG) أو بورمورفامين سينتج أنماطا ظاهرية بطنية.
- لتوليد أسلاف الخلايا النجمية والخلايا النجمية في مجاميع ثلاثية الأبعاد متكونة تلقائيا (hAstrospheres) ، قم بالتبديل إلى NM + EGF + FGF2 وتغذي أسبوعيا (أو حسب الحاجة لضمان استقرار درجة الحموضة) كما هو مفصل سابقا.
- قم بفصل مجاميع hAstro برفق بمحلول الانفصال عند ظهور المراكز الداكنة وإزالة الكرات التي تلتصق تلقائيا. اكسر الكرات برفق مرة واحدة في الأسبوع للحفاظ على صحة الكرة وتجنب النوى النخرية.
ملاحظه: لا تتجاوز 5 دقائق من العلاج بمحلول الانفصال.
- بعد 4-6 أشهر من التمدد ، تأكد من هوية الخلية وإما تجميدها في وسط الحفظ بالتبريد (وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) أو ظروف تخزين بديلة للحفظ طويل الأمد في النيتروجين السائل أو استخدمها على الفور للتجريب.
