مقالة منهجية

تمييز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات غير المعدلة وراثيا إلى خلايا سلفية عصبية

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >المصدر: Cvetkovic، C.، et al. نمذجة الدوائر الدقيقة المشبكية مع الثقافات المشتركة ثلاثية الأبعاد للخلايا النجمية والخلايا العصبية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو توليد الخلايا السلفية العصبية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات غير المعدلة وراثيا والمعدلة وراثيا (hPSCs). يتم تمييز hPSCs إلى خلايا سلفة عصبية باستخدام وسيط تمايز عصبي. بينما يتم تحفيز التمايز في الخلايا غير المعدلة وراثيا باستخدام جزيئات صغيرة ، يتم تمييز hPSCs المعدلة وراثيا عن طريق إضافة مضاد حيوي يحفز المحفز لعامل نسخ خاص بالتمايز العصبي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على الموافقات الأخلاقية عند إجراء التجارب.

< p class = "jove_title" >1. زراعة الخلايا وإعداد الكاشف

  1. تحضير الألواح المطلية لزراعة الخلايا.
      قم
    1. بتخفيف محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية (ECM) باستخدام وسائط Modified Eagle Medium/Nutrient Blend F-12 (DMEM / F12) من Dulbecco لتحضير محلول مخزون 1 مجم / مل. قم بتخزين محلول مخزون ECM المخفف في 30 أنبوبا مخروطيا سعة كل منها 3 مل وخزنها على الفور في -20 درجة مئوية. للحصول على حل عملي، أعد تعليق 3 مل من مخزون ECM إلى 33 مل من وسائط DMEM/F12 المبردة مسبقا، ليصل الحجم الإجمالي إلى 36 مل بتركيز 80 ميكروغرام/مل.
    2. قم بتغطية 1 مل لكل بئر من لوحة زراعة الخلايا المكونة من 6 آبار باستخدام محلول عمل ECM. أضف 1 مل إضافي من DMEM / F12 لكل بئر (إذا لزم الأمر) لضمان تغطية سطح البئر بالكامل. اسمح لألواح زراعة الخلايا المطلية المكونة من 6 آبار بالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل الاستخدام.
      ملاحظه: يمكن تخزين الألواح المطلية في الحاضنة أو عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  2. تحضير تركيبات الوسائط وعوامل النمو والجزيئات الصغيرة.
    1. لتحضير 500 مل من وسط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) ، أضف مكملات 20x و 500x وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
    2. لتحضير 500 مل من الوسط العصبي (NM) ، أضف الهيبارين إلى التركيز النهائي البالغ 2 مجم / مل ، أو 1x من محلول المضادات الحيوية / مضادات الفطريات ، أو 1x B27 أو 1x N2 مكمل إلى زجاجة 500 مل من DMEM / F12 مع مكمل L-glutamine كما هو مفصل سابقا.
    3. لتحضير محلول مخزون 10 ملي مولار (1,000 ضعف) من مثبط Rho-Kinase Y27632 (Y) ، أضف 10 مجم من المسحوق إلى 3 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). قم بتعقيم الترشيح ، وتخزينه عند -20 درجة مئوية ، استخدم بتركيز عمل 10 ميكرومتر في الوسائط.
    4. لتحضير محلول مخزون 20 ملي مولار (10,000 ضعف) من SB431542 ، أضف 10 مجم من المسحوق إلى 1.3 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). لتحضير محلول مخزون 2 ملي مولار (1,000 ضعف) من DMH1 (4- [6- (4-Isopropoxyphenyl) بيرازولو [1،5-a] بيريميدين-3-يل] كينولين ، 4- [6- [4- (1-ميثيل إيثوكسي) فينيل] بيرازولو [1،5-أ] بيريميدين -3-يل] -كينولين) ، أضف 10 مجم من المسحوق إلى 13.1 مل من DMSO. قم بتصفية التعقيم والكمية وتخزين كل محلول عند -20 درجة مئوية. استخدم كل منها بتركيز عمل 2 ميكرومتر في الوسائط (NM + SB431542 + DMH1).
      ملاحظه: يوصي هذا البروتوكول بتركيزات عمل 2 ميكرومتر لكل من SB431542 و DMH1 بناء على ملاحظاتنا وتقارير من الآخرين تفيد بأن هذا التركيز يعزز بشكل فعال الحث العصبي من hPSCs. كما تم الإبلاغ عن تركيزات أعلى. بالإضافة إلى ذلك ، مع الوسائط البديلة ، فقد ثبت أيضا أن الجزيئات الصغيرة ليست ضرورية للتحويل العصبي العالي. وبالتالي ، ستختلف تركيزات العمل اعتمادا على بيئات زراعة الخلايا البديلة ، ويجب اختبار التركيزات المثلى من قبل الباحثين الأفراد.
    5. لتحضير محلول مخزون من دوكسيسيكلين هيدروكلوريد (Dox) ، قم أولا بإذابة المسحوق في DMSO إلى 100 مجم / مل وتخزينه في -20 درجة مئوية. قم بتخفيفه بشكل أكبر لصنع محلول مخزون 2 مجم / مل (1,000 ضعف) في PBS وتخزينه عند -20 درجة مئوية. على سبيل المثال ، أضف 50 ميكرولتر دوكس إلى 50 مل من NM (NM + Dox).
      ملاحظه: لا تقم بإعادة تجميد المحاليل بعد الذوبان.
< p class = "jove_title" >2. توليد الأنواع الفرعية العصبية من الخلايا متعددة القدرات المستحثة البشرية (hPSCs)

ملاحظة: يجب الحفاظ على جميع مزارع الخلايا في حاضنة بها 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 عند 37 درجة مئوية. يتم الحفاظ على هذه الثقافات عند مستويات الأكسجين في الغرفة ، على الرغم من أنه يمكن استخدام مستويات أقل.

  1. توليد وصيانة أسلاف الخلايا النجمية (hAstros) من hPSCs.< / > ملاحظه: يوفر هذا القسم بروتوكول تمايز موجزا ومبسطا. (الشكل 1 أ ، مربع أخضر منقط).
    1. مجموعات بذور hPSCs (الشكل 1 ب) على ألواح 6 آبار مطلية ب ECM مع 2 مل من متوسط hPSC + Y لكل بئر. قم بتغذية الخلايا الجذعية كل يوم حتى تتلاقى حوالي 50٪ وتنقسم حسب الحاجة.
      1. لتقسيم hPSCs ، أضف 1 مل من الكاشف المقطع إلى الآبار والشفق بعد 1 دقيقة. احتضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، وأضف 1 مل من وسط hPSC ، وقم بتقسيم الركام 1:10 على آبار جديدة مطلية ب ECM في 2 مل من متوسط hPSC + Y لكل بئر.
    2. حافظ على الخلايا الجذعية حتى تتلاقى حوالي 50٪ ، ثم قم بتغيير الوسائط إلى NM + SB431542 + DMH1 للحث على التمايز العصبي (اليوم 0). عندما تكون الخلايا ملتصقة بنسبة 95٪ ، قم بتقسيم 1: 6 إلى آبار جديدة مغلفة ب ECM في نفس الوسط.
    3. في اليوم 14 ، قم بفصل الخلايا بمحلول الانفصال ونقلها إلى قارورة غير مطلية مع Y لتعزيز تكوين الركام.
      ملاحظه: يتم استخدام إضافة Y لتعزيز بقاء الخلايا وتكوين الكرة ولكن لا يتم تضمينها أثناء كل تغذية.
    4. لتوليد الأسلاف العصبية والخلايا العصبية (hNeurons) ، استخدم خلايا اليوم 14 هذه للتمييز كما هو موضح للخلايا المعدلة وراثيا.
  2. توليد الخلايا العصبية المحفزة (iNeurons) والحفاظ عليها من hPSCs.​
    1. hPSCs المعدلة وراثيا للبذور (مع جين معدل نيوروجينين 2 محفز للدوكسيسيكلين مستقر) على ألواح 6 آبار مطلية ب ECM مع 2 مل من وسط hPSC + Y لكل بئر (كما هو موضح أعلاه للخطوط غير المعدلة وراثيا). قم بإطعامها يوميا ب 2 مل من الوسائط لكل بئر حتى تصبح جاهزة للرفع عند التقاء 70٪. انقسام الخلايا كما هو موضح أعلاه.
    2. عندما تكون الخلايا حوالي 35٪ ملتقية ، أضف NM + Dox للحث على التمايز في iNeurons.
      ملاحظه: ستنتقل الخلايا إلى أسلاف عصبية ولكنها لن تمتد بعد إلى الأعصاب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: تصوير تدريجي لتمايز وتشكيل المجالات العصبية ثلاثية الأبعاد المشتقة من hPSCs. (أ) الجدول الزمني للخطوات الرئيسية في البروتوكول. (ب) يمكن إنشاء مجموعات نقية من الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hPSCs). (ج) تظهر الخلايا العصبية المحفزة (iNeurons ؛ انظر القسم 2.2) التي تم إنشاؤها من hPSCs المعدلة وراث...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 6 صحن بئر فيشر ساينتيك 08-772-1 ب 15 مل أنابيب مخروطية أوليمبوس بلاستيك 28-101 أكوتاز سيغما A6964-100 مل حل الانفصال ب 27 ثيرموفيشر 17504044 ملحق الوسائط الوسط العصبي BrainPhys تقنيات الخلايا الجذعية 5790 بديل الوسط القاعدي العصبي DMEM / F12 ثيرموفيشر هاتف: 10565-042 مع مكمل GlutaMAX DMH-1 تقنيات الخلايا الجذعية 73634 خطر: سام إذا ابتلع. تركيز العمل: 2 ميكرومتر دوكسيسيكلين هيدروكلوريد (دوكس) سيغما D3072-1 مل خطر: سام للنساء الحوامل. تركيز العمل: 2 ميكروغرام / مل مقياس الدم أو عداد الخلايا الأوتوماتيكي تقنيات الحياة AMQAX1000 الهيبارين سيغما H3149-50KU تركيز العمل: 2 مجم / مل مصفوفة غشاء Matrigel كورنينج 354230 حل طلاء ECM. تركيز العمل: 80 ميكروغرام / مل. استعد على الثلج وتأكد من تبريد الماصات والأنابيب والوسائط مسبقا. N2 ثيرموفيشر 17502048 ملحق الوسائط محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) تقنيات الخلايا الجذعية CA008-300 بولي ل أورنيثين (PLO) سيغما P3655-100 ملغ تركيز العمل: 0.5 مجم / مل ريلير إس آر تقنيات الخلايا الجذعية 5872 كاشف الانفصال والمرور مثبط Rho-Kinase Y27632- (Y) توكرس 1254 تركيز العمل: 10 ميكرومتر SB431542 تقنيات الخلايا الجذعية 72234 تركيز العمل: 2 ميكرومتر قارورة ثقافة T25 أوليمبوس بلاستيك 25-207 قبعات ذات فتحات تهوية قارورة ثقافة T75 أوليمبوس بلاستيك 25-209 قبعات ذات فتحات تهوية TeSR-E8 متوسطة قاعدية تقنيات الخلايا الجذعية 5940 وسط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) مكملات TeSR-E8 تقنيات الخلايا الجذعية 5940 مكملات غذائية لوسط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات تريبان بلو إنفيتروجين تي 10282

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة