توليد مجالات الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد للخلايا النجمية والخلايا العصبية للحث على تكوين المشبك

الملخص

المصدر: Cvetkovic, C., et al. نمذجة الدوائر الدقيقة المشبكية مع الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد للخلايا النجمية والخلايا العصبية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو إجراء للزراعة المشتركة للخلايا النجمية والخلايا العصبية لتشكيل مجالات ثلاثية الأبعاد. توفر هذه المجالات ثلاثية الأبعاد منصة متميزة لفحص تكوين المشبك العصبي وتكامل الشبكة العصبية ، وبالتالي تكون بمثابة نموذج محتمل للبحث في علم الأعصاب التنموي ، والأمراض التنكسية العصبية ، والتدخلات العصبية الدوائية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. إعداد وصيانة المزارع المشتركة 3D Sphere

1. فصل hAstros عن المجاميع ثلاثية الأبعاد في التعليق.​
   1. قم بفصل مجاميع الخلايا النجمية البشرية (hAstro) برفق بمحلول الانفصال عند ظهور المراكز المظلمة وإزالة الكرات التي تلتصق تلقائيا. اكسر الكرات برفق مرة واحدة في الأسبوع للحفاظ على صحة الكرة وتجنب النوى النخرية.
      ملاحظة: لا تتجاوز 5 دقائق من العلاج بمحلول الانفصال.
2. فصل hNeurons أو iNeurons من طبقة أحادية ثنائية الأبعاد.
   1. قم بإزالة الوسائط من اللوحة المكونة من 6 آبار وأضف 500 ميكرولتر من محلول الانفصال إلى كل ثقافة أحادية الطبقة تحتوي على طبقة جيدة من hNeuron (الخلايا العصبية البشرية) أو iNeurons (الخلايا العصبية المحفزة). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أضف 2-3 مل من الوسط القاعدي DMEM / F12 برفق لإزالة الخلايا المرفقة.
   2. اجمع الخلايا والوسائط في أنبوب مخروطي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 1 دقيقة. قم بشفط المادة الطافية ، وأضف 1 مل من الوسائط الجديدة ، وقم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل برفق باستخدام ماصة دقيقة سعة 1,000 ميكرولتر لتحقيق تعليق أحادي الخلية.
3. تشكيل المجالات 3D باستخدام لوحات ثقافة microwell.
   1. قم بإعداد اللوحة عن طريق إضافة 0.5 مل من محلول الشطف المضاد للالتصاق إلى كل بئر من لوحة الميكروويل. لوحة الطرد المركزي عند 2,000 × جم لمدة 5 دقائق. شفط محلول الشطف ، أضف 1 مل من الوسط القاعدي DMEM / F12 إلى كل بئر لغسلها ، والشفق مرة أخرى.
      ملاحظه: تأكد دائما من أن جهاز الطرد المركزي متوازن أثناء الاستخدام.
   2. عد كل نوع من أنواع الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الآلي. أضف النسبة المطلوبة من hAstros و hNeurons أو iNeurons المنفصلة إلى كل بئر في حجم إجمالي قدره 2 مل من الوسط العصبي (NM) + Y (بما في ذلك Dox إذا تم استخدام iNeurons). لوحة الطرد المركزي عند 100 × جم لمدة 3 دقائق والعودة إلى الحاضنة.
      ملاحظة: تحتوي ألواح الآبار الصغيرة المكونة من 24 بئرا (انظر جدول المواد) على 300 بئر صغير لكل بئر. أضف ما لا يقل عن 6 × 10⁵ خلايا (للكرات المكونة من 2 × 10^{3 خلايا لكل} منها) وبحد أقصى 6 × 10⁶ خلايا (للكرات التي يبلغ عدد 2 × 10^{4 خلايا لكل} منها) في 2 مل من الوسائط لكل بئر. بالنسبة للمجالات القابلة للحياة ذات الكثافة المحددة ضمن هذا النطاق ، استخدم كمية محددة من الخلايا واقسمها على 300 لحساب عدد الخلايا لكل كرة. يمكن أيضا استخدام طرق وأدوات بديلة لتشكيل الكرة إذا رغبت في ذلك. اتبع تعليمات الشركة المصنعة للنطاقات المقبولة لكثافة الخلايا.
   3. اسمح للخلايا بالتجمع الذاتي في كرات معبأة بكثافة داخل ألواح microwell خلال اليومين المقبلين (الشكل 1 أ). استبدل 50٪ من الوسائط إذا كانت الثقافة صفراء.
      ملاحظه: استبدل نصف الوسائط والماصة برفق فقط عند إزالة الوسائط وإضافتها حتى لا تزعج الكرات. قد ترتفع الكرات من الآبار الصغيرة وتندمج معا بقوة أعلى.
   4. بعد يومين ، قم بإزالة الكرات برفق من الآبار الصغيرة باستخدام ماصة دقيقة سعة 1,000 ميكرولتر (الشكل 2 د). استخدم القوة برفق على قاع الآبار الصغيرة باستخدام الوسائط لإزالة أي كرات إضافية ملتصقة. دع الكرات تستقر في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، واستنشق الوسائط القديمة ، وأضف وسائط جديدة.
4. قم بإعداد نظام المفاعل الحيوي للقارورة الدوارة لتشكيل المجالات ثلاثية الأبعاد.​
   1. نظف سطح لوحة التحريك المغناطيسية بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وضعها في حاضنة زراعة الخلايا. قوارير دوارة فردية للأوتوكلاف للتعقيم.
   2. أضف كرات بوسائط لا تقل عن 50-60 مل لكل قارورة دوارة (الشكل 2D ، داخلية). ضع القارورة على لوحة التحريك المغناطيسية المضبوطة على 60 دورة في الدقيقة. مجالات الثقافة في قوارير دوارة حتى تصبح جاهزة لجمع البيانات.
      ملاحظه: هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 3 أسابيع في الثقافة لتكوين المشبك العصبي.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: التوليد المنهجي والقابل للتكرار للمجالات العصبية ثلاثية الأبعاد المهندسة بيولوجيا. (أ) تستخدم لوحات ثقافة Microwell (μ-well) لتشكيل مجالات عصبية ثلاثية الأبعاد ذات الكثافة المرغوبة ونسب الخلايا العصبية إلى الخلايا النجمية بطريقة منهجية ومحددة من قبل المستخدم ، مما ينتج عنه حجم وشكل متسق. يتم عرض الصور بعد يوم واحد من تكوين الكرة. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 6 صحن بئر فيشر ساينتيك 08-772-1 ب 15 مل أنابيب مخروطية الشكل أوليمبوس بلاستيك 28-101 أكوتاز سيغما A6964-100 مل حل الانفصال لوحة AggreWell تقنيات الخلايا الجذعية 34850 محلول شطف مضاد للالتصاق تقنيات الخلايا الجذعية 7010 منع التصاق الخلايا بألواح الميكروويل مضاد / مضاد ثيرموفيشر 15240062 ب 27 ثيرموفيشر 17504044 ملحق الوسائط الوسط العصبي BrainPhys تقنيات الخلايا الجذعية 5790 بديل الوسط القاعدي العصبي DMEM / F12 ثيرموفيشر هاتف: 10565-042 مع مكمل GlutaMAX DMH-1 تقنيات الخلايا الجذعية 73634 خطر: سام إذا ابتلع. تركيز العمل: 2 ميكرومتر مصل الحمار مختبرات لامبير البيولوجية 7332100 تركيز العمل: 5٪ في مخزن الحظر الأولي ، 1٪ في المخزن المؤقت للحجب الثانوي دوكسيسيكلين هيدروكلوريد (دوكس) سيغما D3072-1 مل خطر: سام للنساء الحوامل. تركيز العمل: 2 ميكروغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF) بيبروتك AF-100-15 تركيز العمل: 10 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية -2 (FGF) بيبروتك 100-18 ب تركيز العمل: 10 نانوغرام / مل مقياس الدم أو عداد الخلايا الأوتوماتيكي تقنيات الحياة AMQAX1000 مصفوفة غشاء Matrigel كورنينج 354230 حل طلاء ECM. تركيز العمل: 80 ميكروغرام / مل. استعد على الثلج وتأكد من تبريد الماصات والأنابيب والوسائط مسبقا. نظام MEA 2100 أنظمة متعددة القنوات MEA2100 مثبط Rho-Kinase Y27632- (Y) توكرس 1254 تركيز العمل: 10 ميكرومتر SB431542 تقنيات الخلايا الجذعية 72234 تركيز العمل: 2 ميكرومتر قوارير دوارة فيشر ساينتيك 4500-125 قارورة ثقافة T25 أوليمبوس بلاستيك 25-207 قبعات ذات فتحات تهوية تريبان بلو إنفيتروجين تي 10282