توليد خلايا شبيهة بخلايا شوان من الخلايا اللحمية لنخاع العظام

الملخص

المصدر: Tsui ، Y. ، et al. التكييف المسبق لنقص التأكسج للخلايا السلفية المشتقة من النخاع كمصدر لتوليد خلايا شوان الناضجة.J. Vis. Exp. (2017)

< p class = "jove_content">يوضح هذا الفيديو طريقة للحصول على خلايا شبيهة بخلايا شوان من الخلايا اللحمية لنخاع العظم متعددة القدرات (BMSCs). في البداية ، تخضع BMSCs لعلاج نقص الأكسجة ، يليه التمايز الموجه إلى الخلايا السلفية العصبية. بعد ذلك ، يتم استخدام ظروف وسائط وثقافة محددة للحث على تحويل هذه الخلايا السلفية إلى خلايا شبيهة بخلايا شوان.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. تحضير ثقافات الفئران MSC

1. حصاد الخلايا الجذعية الجذعية من عظم الفخذ
   قم
   1. بالتعقيم بجميع أدوات التشريح (مثل مقص التشريح الناعم ، ومقص القطع ذو الرأس الحاد ، والملقط المسنن) عند 180 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل قبل الاستخدام.
   2. تحضير وسط نمو MSC الذي يتكون من الحد الأدنى من الوسط الأساسي - تعديل ألفا (αMEM) مكمل بمصل بقري الجنين بنسبة 15٪ (FBS) والبنسلين / الستربتومايسين (P / S ، 1٪ v / v).
   3. التضحية بفئران Sprague Dawley الذكور الشابة (200-250 جم من وزن الجسم) عن طريق جرعة زائدة من البنتوباربيتون (240 مجم / كجم من وزن الجسم ، داخل الصفاق).
      ملاحظه: يجب معالجة عينات النخاع من الفئران المختلفة بشكل منفصل.
   4. ضع المضحية في وضع ضعيف. نظف البطن والأطراف السفلية جيدا باستخدام 70٪ من الإيثانول.
   5. قم بإزالة الجلد والأنسجة تحت الجلد فوق الفخذين الإنسي باستخدام مقص تشريح دقيق وملقط. قم بإزالة عضلات الفخذ بشكل محيطي حتى ينكشف عظم الفخذ. استمر في ذلك بشكل قريب وبعيد حتى تظهر مفاصل الركبة والورك. قم بتفكيك عظم الفخذ من خلال مفصل الورك والركبة باستخدام مقص القطع ذو الرأس الحاد.
      ملاحظه: لا تقم بتمرير عظم الفخذ لكشف تجويف النخاع في هذه المرحلة. انقل عظم الفخذ السليم إلى غطاء مزرعة الأنسجة الرقائقي لمزيد من المعالجة.
   6. استخدم مقص القطع ذو الرؤوس الحادة لتمرير الأطراف البعيدة والقريبة من عظم الفخذ من خلال الميتافيزيق.
   7. ضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أدخل حقنة 21 جم ، 10 مل تحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، 10 ملي Na₂HPO₄ ، درجة الحموضة 7.4) في قناة الفخذ المكشوفة وقم بغسل محتوى النخاع في الأنبوب المخروطي عن طريق التنظيف المتكرر.
      ملاحظه: يتم استخدام ما يقرب من 20 مل من PBS لغسل كل عظم الفخذ. إذا ظل لون المحتوى المتدفقة ملطخا بالدم وعكرا ، فيمكن استخدام حجم أكبر.
   8. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 480 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من وسط نمو MSC. ضع الخلايا في طبق زراعة أنسجة مقاس 10 سم. ضع أطباق زراعة الأنسجة في حاضنة خلية (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}). سجل اليوم الأول للطلاء على أنه يوم 0.
      ملاحظه: في جميع الخطوات التي تنطوي على الطرد المركزي ، اضبط الفرامل على أقصى قدر من التباطؤ.
2. إنشاء وتوسيع مستعمرات MSC
   ملاحظه: يعتمد هذا البروتوكول على الالتصاق بلاستيك لزراعة الأنسجة لتحديد الخلايا الجذعية الجذعية من داخل تجويف النخاع. يسمح لمحتوى نخاع العظم بالالتصاق ببلاستيك زراعة الأنسجة لمدة يومين.
   1. في اليوم 2 ، اشطف ألواح المزرعة ثلاث مرات باستخدام 10 مل من PBS لإزالة الخلايا غير الملتصقة. استبدل PBS ب 10 مل من وسط نمو MSC بعد الشطف. اغسل الخلايا باستخدام PBS وتجديدها بوسط نمو MSC كل 3 أيام.
      ملاحظه: يجب أن تكون مستعمرات MSC مرئية بحلول اليوم 6-7 (الشكل 1 أ).
   2. قم بتمرير الخلايا بحلول اليوم 10 عن طريق إزالة وسط النمو وشطف الخلايا باستخدام PBS. أضف 1.5 مل من كاشف تفكك الخلايا الأنزيمي المؤتلف واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أضف 3 مل من وسط نمو MSC لتحييد التفاعل. اجمع الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق.
   3. حدد الخلايا داخل الحبيبات باستخدام مقياس كثافة الدم بعد التخفيف المناسب في PBS.
   4. تمر البذور بخلايا بكثافة 40,000 خلية / سم² في صفيحة استزراع 10 سم في وسط نمو MSC.
      ملاحظه: يجب أن تصل الخلايا الجذعية الجذعية للفئران إلى 80-90٪ من التقاء في غضون يومين من المرور (الشكل 1 ب). يمكن تمرير الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.2.2 لما يصل إلى 8 مآمر. يمكن وصف الخلايا الجذعية الجذعية باستخدام الكيمياء الخلوية المناعية وقدرتها على التمايز الثلاثي (الشكل 2). فقط ثقافات MSC بين المقطعين 3 و 8 تخضع للتكييف المسبق اللاحق لنقص الأكسجين وإثراء السلف العصبي. تتبنى الخلايا الجذعية الجذعية ذات العدد الأكبر من التمرير مورفولوجيا مسطحة (الشكل 1 ج) ولا تنتج أسلاف عصبية كافية. يجب التخلص من هذه الثقافات.

< p class = "jove_title" >2. تحضير ثقافات BMSC البشرية

1. قم بتخفيف 1 مل من نخاع العظم البشري مع 9 مل من وسط نمو MSC وقم بوضع الخلايا على طبق زراعة أنسجة بطول 10 سم. الحفاظ على المزارع في حاضنة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}).
2. قم بإزالة الوسط بعد يومين واشطف الثقافات برفق ثلاث مرات باستخدام 10 مل من PBS لإزالة الخلايا غير الملتصقة. بعد الشطف النهائي ، قم بإزالة PBS واستبدله ب 10 مل من وسط نمو MSC. قم بتجديد وسط النمو بعد كل 3 أيام من الثقافة بعد شطف PBS.
   ملاحظه: يجب أن تكون مستعمرات MSC مرئية بحلول اليوم 6-7. قد يختلف عدد المستعمرات بين الموضوعات.
3. قم بتمرير الخلايا في اليوم 10 ، كما هو موضح في الخطوة 1.2.2. حدد الخلايا داخل الحبيبات باستخدام مقياس كثافة الدم بعد التخفيف المناسب في PBS. قم بزرع الخلايا التي تم تمريرها بكثافة 40,000 خلية / سم² على صفيحة استزراع 10 سم في وسط نمو MSC.
   ملاحظه: تظهر الخلايا الجذعية الجذعية البشرية (الشكل 1 د) مورفولوجيا مشابهة للخلايا الجذعية الجذعية للفئران ويجب أن تصل إلى 80-90٪ التقاء في غضون يومين من المرور. يجب تمييزها باستخدام الكيمياء الخلوية المناعية وقدرتها على التمايز الثلاثي. كما هو الحال مع الخلايا الجذعية الجذعية للفئران ، تخضع الخلايا الجذعية الجذعية البشرية بين الممرات 3 و 8 للتكييف المسبق اللاحق لنقص الأكسجين وإثراء السلف العصبي.

< p class = "jove_title" >3. التكييف المسبق لنقص الأكسجين

قم
1. بتفكيك مكونات غرفة نقص الأكسجة (مثل القاعدة والغطاء والصواني) بعد تحرير المشبك الدائري وتنظيف الأجزاء الفردية بنسبة 70٪ من الإيثانول. ضع مكونات الغرفة داخل غطاء لزراعة الأنسجة ذات التدفق الرقائقي للتعقيم تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
2. قبل التكييف المسبق لنقص الأكسجين ، قم بإزالة الوسط واشطف مزارع الفئران والخلايا الجذعية الجذعية البشرية (القسمان 1 و 2) ب 10 مل من PBS. يستعاض عن PBS ب 10 مل من وسط نمو MSC مكمل ب 25 mM HEPES.
   ملاحظه: يجب أن تصل الخلايا الجذعية الجذعية المزروعة على أطباق 10 سم إلى 80-90٪ قبل أن تخضع للتكييف المسبق لنقص الأكسجة.
3. ضع أطباق الثقافة داخل غرفة نقص الأكسجة. أعد تجميع مكونات الغرفة وشد المشبك الحلقي. اغسل خليط غاز بنسبة 99٪ N₂/1٪ O₂ في الغرفة بمعدل تدفق 10 لتر / دقيقة لمدة 5 دقائق.
4. أغلق الأطراف المتصلة لغرفة نقص الأكسجة لضمان عدم تسرب الغاز. ضع الغرفة داخل حاضنة الخلية (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) لمدة 16 ساعة.
5. عند الانتهاء من التكييف المسبق لنقص التأكسج ، قم بإزالة الثقافات من الغرفة استعدادا لثقافة تخصيب السلف العصبي اللاحقة.

4. ثقافة تخصيب السلف العصبي

1. تحضير وسط السلف العصبي الذي يتكون من وسط النسر المعدل من Dulbecco / خليط المغذيات لحم الخنزير F12 (DMEM / F12) مكمل ب B27 (2٪ v / v) ، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF ، 20 نانوغرام / مل) ، عامل نمو البشرة (EGF ، 20 نانوغرام / مل) ، و P / S (1٪ v / v).
2. افصل الفئران المشروط مسبقا / الخلايا الجذعية الجذعية البشرية ، كما هو موضح في الخطوة 1.2.2. اجمع الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق. حدد الخلايا داخل الحبيبات باستخدام مقياس كثافة الدم بعد التخفيف المناسب في PBS.
3. أعد تعليق الخلايا في وسط السلف العصبي والبذور على صفائح منخفضة الارتباط ، 6 آبار بكثافة 6,000 خلية / سم². ضع المزرعة في حاضنة خلية (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) لمدة 12 يوما. تجديد 75٪ من وسط السلف العصبي كل 3 أيام.
   ملاحظه: يجب ملاحظة مجموعات الخلايا الكبيرة غير الملتصقة بحلول الأيام 6-7. بحلول اليوم 10-12 ، يمكن ملاحظة المجالات العصبية التي يبلغ قطرها ≥ 100 ميكرومتر (الشكل 3). يجب أن تنتج الخلايا الجذعية الجذعية المشروطة بنقص الأكسجين مكرويات عصبية أكثر من الخلايا الجذعية الجذعية المزروعة في ظل الظروف الطبيعية.
4. اجمع المجالات العصبية في اليوم 12 عن طريق شفاقتها إلى ماصة سعة 10 مل ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. الطرد المركزي للمجالات العصبية عند 250 × جم لمدة 5 دقائق < / > ملاحظه: يمكن تمييز المجالات العصبية في اليوم 12 لعلامات السلف العصبية ، مثل nestin و GFAP.

< p class = "jove_title" >5. توليد خلايا شبيهة بخلايا شوان

1. تحضير وسط الحث الدبقي المكون من αMEM مكمل ب β-Heregulin (100 نانوغرام / مل) ، bFGF (10 نانوغرام / مل) ، عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF-AA ، 5 نانوغرام / مل) ، FBS (10٪) ، و P / S (1٪ v / v).
2. قم بوضع المجالات العصبية المحضرة في القسم 4 في ألواح PDL / اللامينين المكونة من 6 آبار بكثافة 5-10 كرات لكل سم² في 1.5 مل من وسط الحث الدبقي لكل بئر. استبدل وسط الحث الدبقي كل يومين بعد شطف الخلايا باستخدام PBS.
   ملاحظه: ينظر إلى الخلايا من المجالات العصبية المصنفة على أنها تهاجر إلى الخارج بحلول اليوم الثاني. بحلول اليوم السابع ، يكون للخلايا المهاجرة مظهر مدبب ويجب أن تظهر الإيجابية المناعية لعلامات خلايا شوان ، ومستقبلات التغذية العصبية p75 (p75) و S100β. يشار إلى هذه الخلايا باسم SCLCs.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: إنشاء مستعمرات MSC. يجب أن تكون مستعمرات MSC الكبيرة مرئية بعد 6-7 أيام من طلاء خلايا نخاع العظم على بلاستيك زراعة الأنسجة. تظهر صورة تمثيلية لمستعمرة MSC للفئران (A) ، بينما تظهر المستعمرات البشرية مظهرا مشابها. يمكن تمرير المستعمرات في اليوم 10. عند التكبير العالي ، تظهر كل من الخلايا الجذعية الجذعية للفئران (B) والبشرية (D) مور...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات α ميم سيغمالدريتش م 4526 DMEM / F12 الرماد الحراري العلمي 12400-024 FBS بيوسيرا FB-1280/500 ب 27 الرماد الحراري العلمي 17504-001 عامل نمو البشرة (EGF) الرماد الحراري العلمي PHG0313 عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) بيبروتك 100-18 ب / 100 أوج عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - AA (PDGF-AA) بيبروتك 100-13 أ مجال Heregulin beta-3 ، EGF (β-Her) ميليبور 01-201 بولي د-يسين (PDL) سيغمالدريتش P7886-1G لامينين الرماد الحراري العلمي 23017015 البنسلين / الستربتومايسين (P / S) ثيرموفيشر العلمي 15140-122 تريبل إكسبريس ثيرموفيشر العلمي هاتف: 12604-013 لوحة 10 سم للثقافة الملتصقة برنامج النقاط التجارية 93100 تستخدم لاختيار MSCs لوحة 6 آبار للثقافة الملتصقة برنامج النقاط التجارية 92006 تستخدم لتوسيع MSCs بعد المرور لوحة UltraLow 6 آبار للثقافة غير الملتصقة كورنينج 3471 تستخدم لإثراء السلف العصبي مضاد للإنسان CD90 (Thy-1) BD Biosciences 555593 مضاد للإنسان CD73 BD Biosciences 550256 مضاد للإنسان / الفئران STRO-1 أنظمة البحث والتطوير MAB1038 مضاد للإنسان CD45 BD Biosciences 555480 غرفة نقص الأكسجة بيلوبس روتنبرغ ميكروفون -101 عازلة HEPES سيغمالدريتش H4034-100G نيستين المعادي للإنسان أنظمة البحث والتطوير MAB1259 مضاد للفئران CD90 (Thy-1) BD Biosciences 554895 مضاد للفئران CD73 BD Biosciences 551123 مكافحة الفئران Nestin BD Biosciences MAB1259 مضاد للفئران CD45 BD Biosciences 554875 مضاد ل S100β داكو Z031101 مضاد للضغط p75 ميليبور MAB5386 مكافحة GFAP سيغمالدريتش جي 3893 توبولين بيتا مضاد للفئة الثالثة (Tuj-1) كوفانس MMS-435P النوى المضادة للإنسان ميليبور MAB1281