عزل الخلايا العصبية DRG والزراعة المشتركة مع سلائف خلايا شوان لتوليد خلايا شوان

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Tsui ، Y ، et al. التكييف المسبق لنقص الأكسجين للخلايا السلفية المشتقة من النخاع كمصدر لتوليد خلايا شوان الناضجة. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو إجراء لعزل الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية (DRG) من أجنة الفئران ومشاركتها مع سلائف خلايا شوان لتوليد خلايا شوان الناضجة. تتم معالجة DRGs المعزولة لعزل الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. يتم زراعة الخلايا المعزولة لتنقية الخلايا العصبية ، والتي يتم استزراعها بعد ذلك مع الخلايا الشبيهة بخلايا شوان (SCLCs) في وسط زراعة مشتركة. يؤدي التفاعل مع الخلايا العصبية DRG إلى نضوج الخلايا العصبية SCLCs في خلايا شوان.

البروتوكول

جيل خلايا شوان الملتزمة بالمصير عبر الزراعة المشتركة مع الخلايا العصبية DRG

فئة

1. تحضير الخلايا العصبية DRG للفئران المنقاة

قم
1. بالتعقيم بجميع أدوات التشريح (مثل مقص التشريح ، والملقط ، وملقطي التشريح المجهري ، ومقص التشريح المجهري) عند 180 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل قبل الاستخدام.
2. قم بتغطية ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار ب poly-D-lysine (PDL ، 10 ميكروغرام / مل في PBS) عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. قم بإزالة PDL واشطفه ب 1.5 متر من PBS لكل بئر.
3. استمر في طلاء الألواح باللون اللامينين (10 ميكروغرام / مل في PBS) عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ، اشطف الألواح ب 1.5 مل من PBS لكل بئر.
4. تحضير وسيط صيانة الخلايا العصبية DRG ، الذي يتكون من وسط عصبي قاعدي مكمل ب B27 (2٪ v / v) ، L-glutamine (1٪ v / v) ، عامل نمو الأعصاب (NGF ، 20 نانوغرام / مل) ، والبنسلين / الستربتومايسين (P / S ، 1٪ v / v).
5. تحضير وسيط تنقية الخلايا العصبية DRG ، الذي يتكون من وسط عصبي قاعدي مكمل ب B27 (2٪ v / v) ، L-glutamine (1٪) ، عامل نمو الأعصاب (NGF ، 20 نانوغرام / مل) ، P / S (1٪) ، فلوروديوكسيوريدين (FDU ، 10 ميكروغرام / مل) ، وأوريدين (10 ميكروغرام / مل).
6. التضحية بالفئران الحامل في يوم الحمل 14-15 عن طريق جرعة زائدة من البنتوباربيتال (240 ملغ/كغ من وزن الجسم، داخل الصفاق).
7. ضع المضحية في وضع ضعيف. نظف بطنهم جيدا باستخدام 70٪ من الإيثانول.
8. اقطع جدار البطن السفلي للحيوان طوليا باستخدام مقص وملقط تشريح دقيق. التعرف على الرحم وإزالته باستخدام مقص التسلخ. قطع جدار الرحم لفضح الأجنة واستخراجها. انقل الأجنة إلى طبق ثقافة معقم مقاس 10 سم مليء ب PBS. ضع طبق الثقافة على الجليد.
9. انقل الجنين المخصص للتشريح إلى طبق مزرعة معقم مقاس 10 سم مليء ب PBS (درجة حرارة الغرفة) وضعه تحت مجهر التشريح. اجعل الجنين في وضع الانبطاح.
   ملاحظه: يمكن رؤية الحبل الشوكي الأبيض و DRGs المرفقة على الجانب الظهري للجنين ، من خلال جلده الشفاف.
10. أدخل ملقطا مجهريا على جانبي الحبل الشوكي واستخدم تشريحا حادا لبدء فصل الحبل الشوكي عن الأنسجة الرخوة المحيطة. اقطع الحبل الشوكي بعيدا عن باستخدام ملقط تشريح دقيق على طول فتحة الرقبة وكعب الذيل. قم بإجراء مزيد من التشريح الحاد على الجانب البطني من الحبل السري لتحريره من الأنسجة الرخوة المحيطة.
11. استخدم ملقط التشريح الدقيق لإزالة الأنسجة الرخوة المتبقية على الجانب الظهري للحبل الشوكي المحرر.
    ملاحظه: في هذه المرحلة ، يجب أن يبقى فقط الحبل الشوكي وجذور الأعصاب و DRG المرفقة.
12. افصل DRGs الفردية عن جذور الأعصاب المتصلة باستخدام ملقط التشريح المجهري. استخدم قلم ماصة متصل بطرف سعة 1 مل لنقل DRGs إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 مل يحتوي على PBS.
    ملاحظه: لكل أنبوب سعة 1.5 مل ، يمكن استيعاب 100 DRGs كحد أقصى.
قم
13. بالطرد المركزي DRGs عند 250 × جم لمدة 5 دقائق وأعد تعليقها في كاشف تفكك الخلايا الأنزيمية المؤتلف (200 ميكرولتر لكل أنبوب). احتضان (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) لمدة 10 دقائق. قم بالطرد المركزي DRGs عند 250 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وإعادة تعليقها في وسط صيانة الخلايا العصبية DRG. قم بفصل الحبيبات عن طريق التخلي اللطيف باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر. حدد الخلايا داخل الحبيبات باستخدام مقياس كثافة الدم بعد التخفيف المناسب.
14. قم بزرع الخلايا بكثافة 5,000 خلية / سم² في ألواح 6 آبار مطلية ب PDL / laminin في 1.5 مل من وسط صيانة الخلايا العصبية DRG لكل بئر. بعد يومين من الثقافة ، قم بإزالة وسيط صيانة الخلايا العصبية DRG ، واشطفه باستخدام PBS ، واستبدله بوسط تنقية الخلايا العصبية DRG.
    ملاحظه: لكل دورة تنقية ، عالج مزارع DRG بوسط تنقية لمدة يومين ، متبوعا بيوم واحد من الحضانة في وسط الصيانة. بعد 3-4 دورات تنقية ، من المتوقع إزالة جميع الخلايا الدبقية الذاتية. يجب أن يستغرق هذا حوالي 14 يوما. اختبار الثقافات المنقاة إيجابية للعلامة العصبية TUJ1 وهي غائبة عن تعبير S100β (الشكل 1).

2. توليد خلايا شبيهة بخلايا شوان

1. تحضير وسط الحث الدبقي يتكون من αMEM (الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسي (MEM) ، تعديلات ألفا) مكملة ب β-Heregulin (100 نانوغرام / مل) ، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF ، 10 نانوغرام / مل) ، عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF-AA ، 5 نانوغرام / مل) ، مصل الأبقار الجنينية (FBS ، 10٪) و P / S (1٪ v / v).
2. قم بوضع المجالات العصبية المحضرة في القسم 4 في ألواح 6 آبار مطلية ب PDL / laminin بكثافة 5-10 كرات لكل سم 2 في 1.5 مل من وسط الحث الدبقي لكل بئر. استبدل وسط الحث الدبقي كل يومين بعد شطف الخلايا باستخدام PBS.
3. ملاحظة: ينظر إلى الخلايا من المجالات العصبية المصنفة وهي تهاجر إلى الخارج بحلول اليوم الثاني. بحلول اليوم السابع ، يكون للخلايا المهاجرة مظهر مدبب ويجب أن تظهر الإيجابية المناعية لعلامات خلايا شوان p75 مستقبلات التغذية العصبية (p75) و S100β7. يشار إلى هذه الخلايا باسم SCLCs.

فئة

3. الزراعة المشتركة ل SCLCs مع الخلايا العصبية DRG

1. تحضير وسط الزراعة المشتركة يتكون من وسيط صيانة الخلايا العصبية DRG (الخطوة 1.1.4) ووسط الحث الدبقي (الخطوة 1.2.1) بنسبة الحجم إلى الحجم 1: 1.
2. تحضير وسط صيانة خلايا شوان يتكون من خليط النسر المعدل / خليط المغذيات F-12 (DMEM / F12)) المكملة ب FBS (5٪) و β-Heregulin (10 نانوغرام / مل) و P / S (1٪ v / v).
3. قم بإزالة وسط الاستزراع من اليوم السابع من الخلايا الثانوية قصيرة ، واشطفها باستخدام PBS ، واحتضانها ب 0.5 مل / بئر من كاشف تفكك الخلايا الأنزيمية المؤتلف عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
4. حدد كمية الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم بعد التخفيف المناسب.
5. قم بزرع الخلايا الخلقية الجنوبية على مزارع الخلايا العصبية DRG المنقاة بكثافة 1,000 خلية / سم². حافظ على المزارع المشتركة لمدة 14 يوما ، مع استبدال متوسط كل يومين.
   ملاحظه: أثناء الزراعة المشتركة ، اكتسبت SCLCs التشكل الشبيه بالمغزل النموذجي لخلايا Schwann الناضجة (الشكل 2). تستمر هذه الخلايا في نمطها الظاهري بعد سحب عوامل النمو وتكون قادرة على تحويل المحاور في المختبر وفي الجسم الحي. يجب مراقبة إيجابية علامات خلايا شوان (أي p75 و S100β) عن طريق التألق المناعي.
6. عند الانتهاء من الزراعة المشتركة ، تمر خلايا شوان المرتبطة بالقدر. استخدم 0.5 مل من كاشف التفكك لكل بئر. حدد كمية الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم بعد التخفيف المناسب.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: إنشاء شبكات DRG للفئران النقية. يتم إنشاء شبكات DRG المنقاة بعد المعالجة النبضية بالعوامل المضادة للانقسام FDU واليوريدين (A). شبكات العصبية الخالية من الخلايا الدبقية الداخلية التي تعبر عن S100β (B) جاهزة للزراعة المشتركة باستخدام SCLCs. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات α ميم سيغمالدريتش م 4526 DMEM / F12 الرماد الحراري العلمي 12400-024 الوسط العصبي القاعدي الرماد الحراري العلمي هاتف: 21103-049 FBS بيوسيرا FB-1280/500 ب 27 الرماد الحراري العلمي 17504-001 عامل نمو البشرة (EGF) الرماد الحراري العلمي PHG0313 عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) بيبروتك 100-18 ب / 100 أوج عامل نمو الأعصاب (NGF) ميليبور NC011 عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - AA (PDGF-AA) بيبروتك 100-13 أ مجال Heregulin beta-3 ، EGF (β Her) ميليبور 01-201 أردين سيغمالدريتش [أو3003] 5-فلورو -2 '- ديوكسيوريدين (FDU) سيغمالدريتش F0503 بولي د-يسين (PDL) سيغمالدريتش P7886-1G لامينين الرماد الحراري العلمي 23017015 جلوتاماكس الرماد الحراري العلمي 35050061 البنسلين / الستربتومايسين (P / S) الرماد الحراري العلمي 15140-122 تريبل إكسبريس الرماد الحراري العلمي هاتف: 12604-013 لوحة 10 سم للثقافة الملتصقة برنامج النقاط التجارية 93100 تستخدم لاختيار الخلايا الجذعية الجذعية عن طريق الالتزام بزراعة الأنسجة لوحة 6 آبار للثقافة الملتصقة برنامج النقاط التجارية 92006 تستخدم لتوسيع MSCs بعد المرور لوحة UltraLow 6 آبار للثقافة غير الملتصقة كورنينج 3471 تستخدم لإثراء السلف العصبي غرفة نقص الأكسجة بيلوبس روتنبرغ ميكروفون -101 عازلة HEPES سيغمالدريتش H4034-100G