طريقة في المختبر لتوليد سقالات الخلايا النجمية داخل أعمدة الهيدروجيل الدقيقة

الملخص

المصدر: Katiyar، K. S. ، et al. شبكات الخلايا النجمية المحاذاة ثلاثية الأبعاد هندسية للأنسجة لتلخيص آليات النمو وتسهيل تجديد الجهاز العصبي. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو طريقة لتوليد سقالات نجمية ثلاثية الأبعاد داخل أعمدة هيدروجيل دقيقة. الجزء الداخلي من الأعمدة الدقيقة مغطى بالكولاجين. يتم إدخال الخلايا النجمية ، التي تلتصق بالكولاجين ، ومع مزيد من الحضانة ، يتم تجميعها ذاتيا في سقالة ثلاثية الأبعاد.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تطوير أعمدة Agarose Hydrogel الدقيقة

1. اصنع محلول الاغاروز 3٪ وزن / حجم (وزن / حجم) عن طريق وزن 3 جم من الاغاروز ونقله إلى دورق معقم يحتوي على 100 مل من محلول ملحي مخزن فوسفات دولبيكو (DPBS). أضف قضيبا مغناطيسيا معقما إلى الدورق ، وضعه على سطح لوح ساخن / محرك. احتفظ بالدورق مغطى لمنع تبخر محتوياته في الخطوة التالية.
2. سخني الاغاروز و DPBS عند درجة حرارة 100 درجة مئوية وقلبي عند 60-120 دورة في الدقيقة. اضبط هذه الإعدادات حسب الضرورة ، وراقب باستمرار تقدم عملية الذوبان حيث يتغير المحلول في البداية من معتم إلى مظهر واضح يدل على أن الاغاروز قد تم إذابته تماما.
   أنذر: الدورق الساخن والمحلول ساخن!
3. عندما يتم تسخين محلول الاغاروز وتقليبه ، استرجع أربعة أطباق بتري فارغة مقاس 10 سم وأضف 20 مل من DPBS إلى اثنين منها. ضع إبر الوخز بالإبر (القطر: 300 ميكرومتر ، الطول: 40 مم) ، وأنابيب شعرية زجاجية ميكرولتر (القطر: 701.04 ميكرومتر ، الطول: 65 مم ، السعة: 25.0 ميكرولتر) ، وموزع لمبة داخل خزانة السلامة الحيوية. عندما يزول محلول الاغاروز السائل ، حافظ على تسخين ثابت عند حوالي 50 درجة مئوية مع التقليب لتجنب هلام الاغاروز.
4. أدخل إبرة الوخز بالإبر في الفتحة السفلية لموزع المصباح. أدخل أنبوبا شعريا فوق الإبرة المعرضة للخارج. قم بتأمين الأنبوب الشعري عن طريق إدخال جزء منه في القسم المطاطي لأسطوانة موزع المصباح.
5. انقل 1 مل من الاغاروز السائل باستخدام ماصة دقيقة إلى سطح طبق بتري فارغ ، وضع أحد طرفي الأنبوب الشعري عموديا (مع إدخال الإبرة) ملامسا للأغروز ، بينما يتم ضغط الغطاء المطاطي لموزع المصباح إلى الداخل. حرر الضغط ببطء على غطاء موزع المصباح لسحب الاغاروز إلى الأنبوب الشعري.
   ملاحظه: يجب أن يتم نقل الاغاروز السائل إلى الأنابيب الشعرية بسرعة. إذا ترك الاغاروز السائل ليبرد على سطح طبق بتري لفترة كافية (حوالي 60 ثانية) ، فإنه يبدأ في الهلام ، مما يمنع الشفط المناسب للأغاروز على طول الأنبوب الشعري.
6. ضع كل مجموعة إبرة أنبوب لمبة في طبق بتري مجاني ، واترك جل الاغاروز داخل الأنابيب الشعرية يتجمد لمدة 5 دقائق. اسحب الأنبوب الشعري بعناية بيديك من السدادة المطاطية في أسطوانة موزع المصباح ، واترك الإبرة وجل الاغاروز في مكانهما داخل الأنبوب.
7. استخرج إبرة الوخز بالإبر يدويا عن طريق سحبها ببطء من الأنبوب الشعري ؛ تنزلق أسطوانة الاغاروز الصلبة حديثا أيضا من الأنبوب في هذا الإجراء ، ولا تزال تحيط بالإبرة. ادفع العمود الدقيق برفق على طول إبرة الوخز بالإبر بطرف ملقط معقم لتحريكه حتى النهاية. ضع الإبرة فوق طبق بتري مفتوح يحتوي على DPBS وادفع العمود الصغير إلى DPBS باستخدام ملقط.
   ملاحظه: إذا بقي عمود الاغاروز الصغير داخل الأنبوب الشعري الزجاجي عند إزالة إبرة الوخز بالإبر ، فادفع عمود الاغاروز الصغير ببطء خارج الأنبوب الشعري بإبرة قياس 25 مم إلى الطبق باستخدام DPBS.
8. عقم المشارط الدقيقة أو الملقط باستخدام معقم الخرز الساخن. اصنع 4٪ وزن / حجم من agarose بوزن 4 جم من agarose ونقله إلى 100 مل من DPBS. سخنيها وحركيها كما هو موضح في الخطوة 1.2 للحصول على محلول أغاروز سائل شفاف بنسبة 4٪. حافظ على تسخين المحلول وتقليبه خلال الخطوات التالية.
9. انقل أطباق بتري التي تحتوي على الأعمدة الدقيقة إلى غطاء التشريح ، وانقل عمودا صغيرا ملقطا دقيقا إلى طبق بتري فارغ. استخدم المجسم للتوجيه البصري ومشرط دقيق لقطع الأعمدة الدقيقة إلى الطول المطلوب. قم بقص كلا الطرفين لتشكيل نهايات مشطوفة بزاوية 45^درجة من الأفقي لتسهيل التعامل مع الأعمدة الدقيقة أثناء المصفوفة خارج الخلية (ECM) وإضافة الخلية.
10. كرر الخطوة السابقة لثلاثة أعمدة صغيرة أخرى في نفس طبق بتري وقم بمحاذاة التركيبات الأربعة بالتوازي مع فصل <3 مم بين كل أسطوانة. قم بتحميل 50 ميكرولتر من محلول الاغاروز بنسبة 4٪ باستخدام ماصة دقيقة وصب خط / خط من السائل فوق مصفوفة الأعمدة الدقيقة لتوصيل التركيبات وتجميعها في مجموعات من أربعة (تسمى فيما يلي "قوارب الأعمدة الصغيرة"). تجنب حركة 4٪ من الاغاروز إلى نهايات الأعمدة الدقيقة ، والتي قد تسد الداخل ، عن طريق تقليل المسافة بين التركيبات وإضافة الاغاروز بسرعة في خط رفيع.
    ملاحظه: لا يلزم ترتيب مجموعات من أربعة أعمدة صغيرة في "قوارب" لتصنيع السقالات النجمية. ومع ذلك ، تعمل القوارب على تسريع عملية التصنيع وتوفير طريقة أكثر أمانا لتحريك الأعمدة الدقيقة والتعامل معها في الخطوات اللاحقة.
11. دع القارب ذو العمود الصغير يبرد لمدة 1-2 دقيقة للسماح بهلام 4٪ من الاغاروز المضاف. التقط القارب ذو العمود الصغير بملقط دقيق عن طريق توصيل 4٪ agarose ، وانقل الأعمدة الدقيقة إلى طبق بتري الآخر المحتوي على DPBS المحضر في الخطوة 1.1.3. قم بتصنيع المزيد من القوارب مع الأعمدة الدقيقة المتبقية حسب الرغبة.
12. انقل أطباق بتري التي تحتوي على الأعمدة الدقيقة و / أو القوارب إلى خزانة السلامة الحيوية وتعقيمها مع التعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 30 دقيقة < / > أنذر: ارتد الحماية المناسبة لمنع التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
13. قم بتخزين الأطباق مع قوارب الأعمدة الدقيقة في DPBS عند 4 درجات مئوية ، إذا لم تحدث إضافة ECM وطلاء الخلية بعد ذلك مباشرة ، حتى أسبوع واحد. كرر خطوات تصنيع الأعمدة الدقيقة إذا لم يتم استخدام البنيات خلال هذا الإطار الزمني.

< p class = "jove_title" >2. ثقافة الخلايا الأولية والعزل

1. عزل الخلايا النجمية القشرية من صغار الفئران
   1. استعدادا للخطوات التالية ، أضف 20 مل من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) إلى أربعة أطباق بتري مقاس 10 سم والتي ستكون بمثابة خزانات للأنسجة التي تم تشريحها. احتفظ بجميع الأطباق على الجليد. عقم المقص الجراحي النظيف والملقط والملعقة الدقيقة والمشارط الدقيقة في معقم الخرز الساخن.
   2. التدفئة المسبقة 0.25٪ التربسين مع 1 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) و 0.15 مجم / مل ديوكسيربونوكلياز (DNase) I في HBSS عند 37 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتسخين وسط زراعة الخلايا النجمية مسبقا عند 37 درجة مئوية ، والذي يتكون من وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع خليط المغذيات F-12 من لحم الخنزير و 10٪ مصل بقري الجنين (FBS).
   3. تخدير صغار الفئران بعد الولادة 0 أو اليوم 1 عن طريق تعريضهم لظروف منخفضة الحرارة والقتل الرحيم بقطع الرأس. قم بتثبيت الرأس في مرحلة باستخدام إبرة قياس 19 مم موضوعة في الخطم الأمامي للعينين.
   4. قم بعمل شق بمشرط أسفل المنتصف الخلفي إلى الأمامي ، من قاعدة الرقبة إلى خلف العينين مباشرة. قم بإجراء شق آخر يمر بشكل جانبي من خلف العينين مباشرة إلى أسفل ، لتشكيل شكل T. استخدم ملقطا دقيقا لسحب جلد الجمجمة / الجمجمة إلى الجانب.
   5. أمسك الرأس من الخطم (متجها لأعلى) عن طريق وضع شق واحد من الملقط في فم والآخر على السطح الخارجي. قم بإزالة الدماغ بملعقة صغيرة معقمة وضعها في أحد أطباق بتري المليئة ب HBSS المبرد. ضع طبق بتري هذا على الثلج بعد ذلك مباشرة وفي جميع الأوقات باستثناء عند الاستخدام.
   6. ضع كتلة من الجرانيت مخزنة مسبقا عند -20 درجة مئوية أسفل مجسم داخل غطاء التشريح. ضع طبق بتري مع أنسجة المخ على سطح كتلة الجرانيت للحفاظ على درجة حرارته المنخفضة أثناء إجراء التشريح. استخدم المجسم كدليل مرئي خلال الخطوات التالية.
   7. إذا ظلت البصيلات الشمية سليمة ، فقم باستخرجها عن طريق القطع بالملقط أو المشارط الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، استخدم مشرط دقيق لإزالة المخيخ وعمل شق في خط الوسط يفصل نصفي الكرة المخية. انقل نصفي الكرة الأرضية بالملقط إلى طبق بتري يحتوي على HBSS طازج ومبرد.
   8. قم بتشريح هياكل الدماغ الأوسط من داخل نصفي الكرة الأرضية باستخدام مشرط دقيق للحصول على القشرة المنفصلة فقط. استخدم ملقطا دقيقا لتقشير السحايا ، وهو هيكل يشبه الصفيحة ، بعيدا عن الأنسجة القشرية ونقل القشرة المعزولة إلى طبق بتري جديد مع HBSS البارد. استخدم المشرط الدقيق لفرم الأنسجة من أجل زيادة مساحة السطح لعمل التربسين في الخطوة التالية.
   9. استخدم ماصة باستور لنقل القشرة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على 4 مل من التربسين-EDTA الدافئ مسبقا (8 قشريات في كل أنبوب). قم بتعريض الأنسجة القشرية للتربسين EDTA لمدة 5-7 دقائق عند 37 درجة مئوية.
   10. باستخدام ماصة باستور، قم بإزالة التربسين-EDTA بعناية وأضف 400 ميكرولتر من محلول 0.15 ملغم/مل DNAse I إلى أنبوب الطرد المركزي. قم بتحريك الأنبوب أو الدوامة حتى يتم تفكك كل الأنسجة ولا توجد قطع أنسجة متبقية في السائل. إذا لم يكن من الممكن إذابة الأنسجة تماما ، فقم بإزالة الأجزاء المتبقية بطرف ماصة باستور.
   11. قم بالطرد المركزي للأنبوب الذي يحتوي على محلول الخلية المنفصلة عند 200 × جم لمدة 3 دقائق. أضف 1 مل من وسط زراعة الخلايا النجمية (المحدد في الخطوة 2.1.2) إلى الأنبوب باستخدام ماصة دقيقة وقم بتحريكها لإعادة تعليقها وإنشاء محلول متجانس.
   12. انقل 10 مل من وسط زراعة الخلايا النجمية باستخدام ماصة مصلية إلى قارورة T-75. أضف 250 ميكرولتر من محلول الخلية سعة 1 مل (المحضر في الخطوة 2.1.11) باستخدام ماصة دقيقة إلى القارورة لوضع خلايا بقيمة دماغ جرو واحد لكل قارورة. وزع محلول الخلية المفرغة بالتساوي عبر وسط المزرعة وحرك القارورة برفق لتعزيز التوزيع المتساوي.
   13. استزراع القوارير المطلية في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. بعد الوصول إلى 24 و 72 ساعة في الثقافة ، قم بتحريك القارورة ميكانيكيا لفصل أنواع الخلايا غير الملتصقة ، مثل الخلايا العصبية والخلايا قليلة التغصن.
   14. بعد ذلك ، في كل نقطة من هذه النقاط الزمنية ، قم بإجراء تغيير الوسائط. أمسك القارورة عموديا بحيث تقع وسائط الثقافة في الجزء السفلي من القارورة ، ولا تغطي الخلايا الملتصقة. استنشق وسط المزرعة باستخدام ماصة باستور، واضغط على طرف الماصة على الزاوية السفلية من القارورة لتجنب استخراج الخلايا. ضع القارورة في الوضع الأفقي الأصلي وأضف برفق 10 مل من وسط الخلايا النجمية فوق الخلايا باستخدام ماصة مصلية.
   15. أعد القوارير إلى الحاضنة بعد كل تغيير للوسائط. بعد تحقيق التقاء بنسبة 90٪ ، قم بتحريك القارورة ميكانيكيا مرة أخرى لإزالة أي خلايا متبقية غير ملتصقة.
   16. قم بتمرير الخلايا النجمية عن طريق إخراج وسط الاستزراع باستخدام فراغ وماصة باستور. أضف 5 مل من 0.25٪ تربسين-EDTA مع ماصة مصلية فوق الخلايا الملتصقة. حرك القارورة برفق للتأكد من أن التربسين يغطي جميع الخلايا ، واحتضان القارورة لمدة 5-7 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
   17. قم بإخماد التربسين عن طريق إضافة 1 مل من وسط الخلايا النجمية إلى الخلايا باستخدام ماصة مصلية. استخرج محلول الخلية من القارورة بماصة مصلية وانقله إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 200 × جم لمدة 3 دقائق.
   18. قم بإزالة المادة الطافية بماصة مصلية وأعد تعليقها في 1 مل من وسط زراعة الخلايا النجمية. حرك الأنبوب للتأكد من أن محلول الخلية متجانس. احسب عدد الخلايا في المحلول باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا التلقائي.
       ملاحظه: عادة ما تنتج القارورة التي تتلاقى 90٪ ما يقرب من 3 ملايين خلية نجمية.
   19. أضف 10 مل من وسط زراعة الخلايا النجمية إلى قارورة T-75. قم بإجراء تخفيف بنسبة 1: 4 عن طريق نقل 250 ميكرولتر من محلول الخلية (الخطوة 2.1.18) باستخدام ماصة دقيقة إلى قارورة T-75 التي تحتوي بالفعل على وسط الاستزراع. حرك برفق لضمان توزيع الخلايا المتجانس في جميع أنحاء سطح القارورة.
   20. كرر الخطوات 2.1.16-2.1.19 في كل مرة يتم فيها تحقيق التقاء بنسبة 90٪ لمرور الخلايا.
2. عزل الخلايا العصبية القشرية من أجنة الفئران
   1. اتبع الاستعدادات المماثلة مثل الخطوتين 2.1.1 و 2.1.2 ، باستثناء أن الوسائط الدافئة مسبقا عبارة عن وسائط استزراع مشترك ، تتكون من وسيط عصبي قاعدي + 2٪ مكمل B-27 (للخلايا العصبية) + 1٪ مكمل خال من المصل G-5 (للخلايا النجمية) + 0.25٪ L-glutamine.
   2. القتل الرحيم لليوم الجنيني الحامل في الوقت المناسب 18 فئران سبراج داولي مع اختناق ثاني أكسيد الكربون وتأكيد الموت بقطع الرأس.
   3. استخرج أجنة الفئران وقم بتشريح القشرة من بقية الأنسجة الدماغية في أطباق بتري التي تحتوي على HBSS على سطح كتلة الجرانيت المبردة ، باستخدام مجسم للتوجيه البصري والمقص المعقم والمشرط الدقيق والملقط. بعد التشريح المتتالي للرؤوس والأدمغة ونصففي الكرة المخية والقشرة ، انقل كل نسيج إلى طبق بتري جديد مليء ب HBSS.
   4. قم بفرم الأنسجة القشرية إلى أجزاء أصغر لزيادة مساحة سطح التربسين. انقل 4-6 قشرية باستخدام ماصة باستور إلى أنبوب به 5 مل من التربسين-EDTA الدافئ مسبقا وحافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية لفصل الأنسجة. في 5-7 دقائق ، حرك الأنبوب يدويا لخلط ومنع تكتل الأنسجة.
   5. قم بإزالة الأنبوب من 37 درجة مئوية بعد 10 دقائق. كما هو موضح سابقا في الخطوة 2.1 ، استخرج التربسين-EDTA واستبدله ب 1.8 مل من محلول DNAse 0.15 مجم / مل. بعد ذلك ، قم بدوامة الأنسجة حتى يبدو المحلول متجانسا ، مع عدم وجود شظايا أنسجة تطفو في السائل.
   6. جهاز الطرد المركزي لمحلول الأنسجة المنفصلة عند 200 × جم لمدة 3 دقائق. بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليقها في 2 مل من وسط الزراعة المشتركة. احسب عدد الخلايا في هذا المحلول باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا التلقائي.
      ملاحظه: العائد المعتاد هو 3.0-5.0 × 10⁶ خلايا / نصف الكرة القشري.
   7. قم بإعداد محلول خلوي جديد بكثافة 2.0-4.0 × 10⁵ خلايا / مل في وسائط الزراعة المشتركة المحددة أعلاه.

3. تطوير الكابلات النجمية داخل الأعمدة الدقيقة

1. تصنيع نواة ECM
   ملاحظة: يجب إضافة ECM إلى الجزء الداخلي من أعمدة الهيدروجيل الدقيقة في نفس اليوم الذي سيتم فيه إجراء بذر الخلايا.
   1. داخل خزانة السلامة الحيوية ، قم بإعداد محلول 1 مجم / مل من الكولاجين من النوع الأول من ذيل الفئران في وسط الزراعة المشتركة في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم. حافظ على أنبوب الطرد المركزي الدقيق بمحلول ECM على الجليد في جميع الأوقات باستثناء وقت الاستخدام.
   2. انقل 1-2 ميكرولتر من محلول ECM باستخدام ماصة دقيقة على شريط من ورق عباد الشمس لتقدير درجة الحموضة. أضف 1 ميكرولتر من 1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) أو حمض الهيدروكلوريك (HCl) مع ماصة دقيقة لزيادة أو تقليل درجة الحموضة لمحلول ECM ، على التوالي ، والماصة لأعلى ولأسفل حتى تتجانس. تحقق من الرقم الهيدروجيني الجديد باستخدام شريط ورق عباد الشمس وأضف المزيد من الحمض أو القاعدة ، حسب الحاجة ، حتى يصبح الرقم الهيدروجيني مستقرا في نطاق 7.2-7.4.
   3. انقل أطباق بتري من الخطوة 1.2 إلى غطاء التشريح ، وانقل 4-5 أعمدة دقيقة أو قارب بملقط ناعم معقم إلى طبق بتري فارغ ومعقم مقاس 35 أو 60 مم. باستخدام المجسم للتوجيه ، ضع طرف 10 ميكرولتر من ماصة دقيقة في أحد طرفي كل عمود دقيق وشفط لتفريغ تجويف DPBS وفقاعات الهواء. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء باستخدام المجسم للتأكد من أن ECM المضافة في الخطوة التالية يمكن أن تتدفق بحرية عبر التجويف.
   4. اشحن ماصة دقيقة P10 بمحلول ECM، ضع الطرف 10 ميكرولتر على أحد طرفي أعمدة الهيدروجيل الدقيقة، وقدم محلولا كافيا لملء التجويف (حوالي 3-5 ميكرولتر)، مع ملاحظة دخول وحدة التحكم في المحرك باستخدام المجسم الماصة خزان صغير (2-4 ميكرولتر) من محلول ECM على طرفي العمود الصغير.
      ملاحظه: قم دائما بإدارة 4-5 أعمدة صغيرة أو قارب واحد في كل مرة لمنع التجفيف المطول للهياكل ، حيث قد يؤدي ذلك إلى تجعد هيكل العمود الصغير. ترتبط الأعمدة الدقيقة المجففة تماما بإحكام بسطح أطباق بتري ، مما يمنع استخدامها لبذر الخلايا. لا يمكن إضافة كميات زائدة من وسائط الاستزراع المشترك (كمقياس ترطيب) إلى الأعمدة الدقيقة لأن هذا قد يتسبب في تدفق ECM خلال فترة الحضانة الموضحة أدناه.
   تقوم
   5. الماصة باستزراع وسائط مشتركة في حلقة حول طبق بتري لتوفير حوض رطوبة لمنع الأعمدة من الجفاف أثناء الحضانة. احتضان طبق بتري الذي يحتوي على الأعمدة الدقيقة المحتوية على ECM عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة ساعة واحدة لتعزيز بلمرة الكولاجين قبل إضافة الخلايا العصبية و / أو الخلايا النجمية.
      ملاحظه: يجب أن يشكل ECM طبقة تغطي السطح الداخلي للتجويف المجوف ، بدلا من نواة ECM الصلبة التي تشمل الداخل ، وكلاهما يمكن ملاحظته باستخدام المجسم المجسم. إذا كان ECM يشكل نواة ، فاستمر في فترة الحضانة حتى يتم ترك الطبقة فقط. مع تشكيل هذه الطبقة ، يمكن لمحلول الخلايا النجمية أن يملأ الجزء الداخلي من العمود الصغير في خطوات الطلاء.
   6. خلال فترة الحضانة ، قم بإعداد محلول الخلايا النجمية (كما هو موضح أدناه).
الخلايا
2. النجمية وبذر الخلايا العصبية في الأعمدة الدقيقة
   1. قم بتمرير الخلايا النجمية المطلية (بين الممر الرابع والثاني عشر) كما هو موضح في الخطوتين 2.1.16-2.1.19. بعد حساب عدد الخلايا في القارورة ، قم بإعداد محلول الخلية بكثافة 9.0-12.0 × 10⁵ خلايا / مل محلول معلق في وسط زراعة الخلايا.
   2. باستخدام منظار مجسم ، ضع طرف ماصة دقيقة P10 في أحد طرفي الأعمدة الدقيقة ، وانقل محلول خلوي كاف (~ 5 ميكرولتر) إلى التجويف لملئه بالكامل. كما هو الحال أعلاه مع ECM ، أضف خزانات صغيرة من محلول الخلية إلى طرفي كل عمود صغير.
   3. احتضان الأعمدة الدقيقة المطلية على أطباق بتري عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة ساعة واحدة لتعزيز ارتباط الخلايا النجمية ب ECM. إذا لم تتم إضافة الخلايا العصبية إلى الأعمدة الدقيقة ، فانتقل إلى الخطوة 3.2.5.
   4. بعد فترة الحضانة الأولية ، أضف 1-2 ميكرولتر من محلول الخلايا العصبية القشرية التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.2.7 في طرفي الأعمدة الدقيقة باستخدام ماصة دقيقة ، أثناء المراقبة تحت المنظار المجسم. تأكد من وجود وسائط كافية في الأطباق لتجنب الجفاف ، واحتضانها مرة أخرى لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} للسماح بالتصاق الخلايا العصبية.
      ملاحظه: يمكن أيضا إضافة محلول الخلايا العصبية القشرية بعد 1-2 أيام من تكوين الحزمة ، وتنفيذ الخطوة 3.2.4 بعد إزالة وسائط الثقافة بعناية من طبق بتري باستخدام ماصة دقيقة.
   5. بعد فترة الحضانة ، املأ بعناية أطباق بتري التي تحتوي على الأعمدة الدقيقة المطلية ب 3 أو 6 مل من وسائط الزراعة المشتركة لأطباق بتري مقاس 35 أو 60 مم ، على التوالي. حافظ على الأعمدة الدقيقة المطلية في الثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} لتعزيز التجميع الذاتي للحزم النجمية المحاذاة ، والتي يجب أن تشكل هيكلا مجمعا يشبه الكابلات بعد 6-10 ساعات.

المواد