تطوير نموذج ثلاثي الأبعاد قائم على الحرير والكولاجين للأنسجة العصبية المستقطبة

Abstract

المصدر: Chwalek، K. et al.، نموذج ثلاثي الأبعاد قائم على الكولاجين الحريري للأنسجة العصبية المستقطبة.J. Vis. إكسب. (2015).

يعرض هذا الفيديو إنشاء نموذج نسيج عصبي مستقطب ثلاثي الأبعاد باستخدام سقالات الكولاجين الحريرية. يفصل عملية بذر الخلايا العصبية على سقالات الحرير المسامية ، واحتضان ارتباط الخلية ، وتضمين السقالة بالكولاجين ، ويؤكد على أهمية مصفوفة الكولاجين الداعمة في تشكيل نموذج الأنسجة العصبية المستقطبة ثلاثية الأبعاد.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. تحضير سقالة الحرير

1. تحضير محلول الحرير من شرانق بومبيكس موري
   1. قطع كل شرنقة إلى 8 قطع متساوية باستخدام المقص. استخدم حوالي 11 شرانق مقابل 5 جم من الشرانق المجزأة. (15 دقيقة)
   2. تحضير 2 لتر من محلول 0.02 M Na₂CO₃ واتركه يغلي باستخدام طبق ساخن. (15 دقيقة)
   3. تزن 5 جم من الشرانق المجزأة وقم بغليها في محلول Na₂CO₃ لمدة 30 دقيقة. هذه الخطوة ، التي تسمى إزالة الصمغ ، تنقي فيبروين الحرير من البروتينات المحبة للماء ، السيريسين. (30 دقيقة)
   4. اعصر الفيبروين يدويا واشطفه بالماء المقطر ثلاث مرات على الأقل لغسل أي سيريسين ومواد كيميائية متبقية. (5 دقائق)
   5. ضع الفيبروين المبلل على طبق بتري وجفف مستخلص الفيبروين في غطاء التدفق O / N.
   6. في اليوم التالي ، قم بوزن كتلة الفيبروين الجافة وضع الفيبروين في دورق زجاجي. (15 دقيقة)
   7. لإذابة الفيبروين في محلول LiBr 9.3 M ، احسب الحجم المطلوب (بالمل) من LiBr بضرب كتلة الفيبروين الجاف في 4. اسكب محلول LiBr ببطء فوق الفيبروين الحريري واستخدم ملعقة لغمر جميع ألياف الفيبروين. قم بتغطية الدورق لمنع التبخر وضعه على درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات للسماح للألياف بالذوبان. (15 دقيقة)
   8. باستخدام المحقنة ، اجمع محلول الفيبروين من الدورق وقم بتحميله في MWCO 3,500 شريط غسيل كلى. إجراء غسيل الكلى ضد الماء المقطر لمدة 48 ساعة. قم بتغيير الماء كل ساعتين.
   9. باستخدام المحقنة ، اجمع محلول الفيبروين من الكاسيت إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي مرتين عند 9,000 دورة في الدقيقة (~ 12,700 × جم) عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد كل خطوة من خطوات الطرد المركزي ، اسكب المادة الطافية في أنبوب جديد وتخلص من الحبيبات. (40 دقيقة)
   10. قم بقياس تركيز الفيبروين عن طريق تقدير الوزن الجاف. صب 1 مل من محلول الحرير في قارب وزن. جفف العينة في الفرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعتين. قم بوزن الفيبروين الحريري الجاف واحسب تركيز محلول الحرير الفيبروين بضرب الوزن الذي تم الحصول عليه في 100. التركيز المتوقع لمحلول الحرير هو 6-9٪ (وزن / حجم).
   11. اضبط تركيز الحرير على 6٪ (وزن / حجم) عن طريق تخفيفه في الماء المقطر.
       نقطة التوقف: يمكن تخزين الفيبروين الحريري السائل عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد في حاوية مغلقة.
2. تحضير السقالات المسامية من محلول الحرير.
   1. غربل كلوريد الصوديوم الحبيبي لفصل حبيبات 500-600 ميكرومتر ، والتي سيتم استخدامها في الخطوات اللاحقة. تخلص من الحبيبات التي يقل حجمها عن 500 ميكرومتر وأعلى من 600 ميكرومتر (15 دقيقة)
   2. صب 30 مل من محلول الحرير بنسبة 6٪ في قالب البولي تترافلورو إيثيلين (PTFE) (الشكل 1). نثر برفق 60 جم من كلوريد الصوديوم المنخل على الحرير. اضغط على الحاوية للحصول على طبقة موحدة من الملح. احتضن 48 ساعة في RT لبلمرة الحرير.
   3. ضع قالب PTFE المحتوي على السقالة في الفرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لإنهاء البلمرة وتبخير أي سائل متبقي.
   4. ضع محتويات قالب PTFE في دورق يحتوي على 2 لتر من الماء المقطر لمدة 48 ساعة لترشيح الملح. قم بتغيير الماء 2-3 مرات في اليوم. قم بإزالة السقالات الإسفنجية من القوالب عندما يتسرب الملح تماما.
      نقطة التوقف: يمكن تخزين الإسفنج مغمورا في الماء عند 4 درجات مئوية في وعاء مغلق لمنع السقالات من الجفاف.
   5. اقطع السقالات بكمة خزعة قطرها 5 مم عندما تكون جاهزة. قم بقص السقالات مسبقا ليصل ارتفاعها إلى حوالي 2 مم. اضرب وسط السقالة باستخدام لكمة الخزعة بقطر 2 مم (الشكل 2 أ). (1 ساعة)
   6. قم بتعقيم السقالات المغمورة في الماء لتعقيمها (دورة رطبة ، 121 درجة مئوية ، 20 دقيقة).
      نقطة التوقف: يمكن تخزين الإسفنج مغمورا في الماء عند 4 درجات مئوية في وعاء مغلق لمنع السقالات من الجفاف.
   7. قبل البذر الخلوي المخطط له ، اغمر السقالات في محلول معقم 0.1 مجم / مل بولي دي ليسين (PDL). احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
   8. اغسل السقالات 3x بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة PDL غير المرتبط. (30 دقيقة)

< p class = "jove_title" >2. عزل الخلايا العصبية القشرية للفئران

1. تشريح القشرة من فئران Sprague-Dawley في اليوم الجنيني 18 (E18) بعد الحصول على بروتوكول المعتمد. (2 ساعة)
2. احتضان 10 قشريات في 5 مل من 0.25٪ تريبسين مع 0.3٪ DNase I (من البنكرياس البقري) لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
3. قم بتعطيل التربسين عن طريق إضافة 1 مجم / مل من بروتين فول الصويا.
4. قم بتقطيع القشرة باستخدام ماصة باستور سعة 10 مل عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 20 مرة حتى يتم إنشاء معلق خلية واحدة. كن لطيفا وتجنب تكوين فقاعة الهواء. (10 دقائق)
5. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 127 × جم لمدة 5 دقائق.
6. أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من وسط المزرعة (الوسط العصبي القاعدي ، 1x مكمل B27 ، 1x Glutamax ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين). عد الخلايا. تركيز الخلية المتوقع حوالي 2 × 10⁷ / مل (20 دقيقة)

< p class = "jove_title" >3. بناء التجميع والثقافة

1. بذر السقالة بالخلايا
   1. انقل السقالات المعقمة وجميع الأواني المطلوبة داخل غطاء مزرعة الخلايا. ضع السقالات في صفيحة زراعة خلوية مكونة من 96 بئرا باستخدام ملقط معقم ، مع تخصيص سقالة واحدة لكل بئر. (10 دقائق)
   2. اغمر السقالات في وسط زراعة الخلايا لتحقيق التوازن فيها قبل بذر الخلايا. احتضان لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية (10 دقائق)
   3. استنشق فائض الوسط من السقالات.
   4. ضع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية / السقالة. (10 دقائق)
   5. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية O / N للسماح بربط الخلية بالسقالة.
   6. في صباح اليوم التالي ، قم بشفط الخلايا غير المرفقة وقم بتطبيق 200 ميكرولتر / بئر من وسط الاستزراع الطازج. (10 دقائق)
2. سقالة مدمجة مع مصفوفة الكولاجين. (2 ساعة)
   1. ضع 10x PBS ، والماء ، و 1 N هيدروكسيد الصوديوم ، وذيل الفئران I الكولاجين على الثلج. قم بإعداد محلول عملي من الكولاجين حسب تعليمات الشركة المصنعة. حافظ على الجليد حتى تصبح التركيبات المصنفة في الخلايا جاهزة (حتى 1 ساعة).
   2. قم بإزالة تركيبات الحرير المصنفة بالخلايا من الحاضنة واستنشق الوسط الزائد.
   3. انقل السقالات إلى الآبار الفارغة على لوح البئر باستخدام ملقط معقم واغمر كل سقالة في 100 ميكرولتر من محلول الكولاجين 3 مجم / مل. ضع لوحة زراعة الأنسجة مرة أخرى في الحاضنة لمدة 30 دقيقة للسماح ببلمرة الكولاجين.
   4. ضع 100 ميكرولتر من وسط / بئر زراعة الخلايا الدافئة مسبقا. استزراع التركيبات لمدة أسبوع واحد ، وتغيير الوسيط كل يوم عن طريق استبدال نصف حجم الوسيط فقط.

Results

الشكل 1. قالب PTFE يستخدم لإعداد سقالة الإسفنج الحريري. الأبعاد: قطر 10 سم ، ارتفاع 2 سم.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 2. 3D نموذج الأنسجة الشبيهة بالدماغ. (أ) سقالة إسفنجية حريرية مسامية. (ب) تلطيخ الخلايا العصبية الحية / الميتة في اليوم الأول ...

Materials