إعادة طلاء الخلايا العصبية المتمايزة المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Calabrese، B. et al. ، إعادة طلاء ما بعد التمايز للخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات للفحص عالي المحتوى لتكوين النواة ونضج المشبك. J. Vis. إكسب. (2019)

يعرض الفيديو طريقة لفصل وإعادة زرع الخلايا العصبية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات باستخدام إنزيم محلل للبروتين خفيف. بعد الترشيح والطرد المركزي ، يتم إعادة طلاء الخلايا العصبية على صفيحة مغلفة متعددة الآبار للحضانة ، مما يعزز التعلق والنضج.

البروتوكول

1. فترة التمايز قبل إعادة الطلاء

1. قم بتمييز الخلايا العصبية في أطباق 10 سم ، باستخدام بروتوكول من اختيارك ، حتى تشكل الخلايا العصبية شبكة سميكة بعملياتها وتعبر ليس فقط عن العلامات العصبية المبكرة مثل MAP2 أو TuJ1 ، ولكن أيضا عن العلامات المتأخرة مثل NeuN.
2. قم بتغيير نصف الوسيط المفضل كل 4 أيام أثناء عملية التمايز العصبي.
   ملاحظه: تؤدي التغيرات المتوسطة الأكثر شمولا أو المتكررة إلى تخفيف العوامل الغذائية الأساسيةaq ويمكن أن تتعارض مع النضج.
   1. بالنسبة للخلايا العصبية WT126 المشتقة من iPSC ، استخدم وسائط الزراعة التالية بعد التمايز: 5 مل 100x N2 (عصبي) الملحق ، 10 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) ، 10 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF) ، 1 ميكروغرام / مل لامينين ، 200 ميكرومتر حمض الأسكوربيك ، 1 ميكرومتر ثنائي بوتيريل-سي كامبير و 10 مل SM1 ل 500 مل خليط النسر المتوسط / المغذي المعدل من Dulbecco F-12 (DMEM / F12). تدريجيا ، باستخدام تغييرات نصف الوسائط ، استبدل بالوسط القاعدي العصبي (جدول المواد) ونفس المكملات الغذائية.
   2. بالنسبة للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات أو الخلايا العصبية CVB WT المشتقة من iPSC ، استخدم وسط زراعة ما بعد التمايز التالي: 500 مل متوسط عصبي قاعدي A (جدول المواد) و 500 مل وسط DMEM / F12 مع 2 ميكروغرام / مل لامينين ، 10 مل مكمل الجلوتامين (جدول المواد) ، 0.75 مجم / مل بيكربونات الصوديوم ، 5 مل الحد الأدنى من الأحماض الأمينية غير الأساسية المتوسطة (MEM) ، 0.2 ملي مولار حمض الأسكوربيك ، 10 نانوغرام / مل BDNF ، 20 مل 50x B27 ، و 10 مل 100x N2 مكمل.

فئة

2. طلاء الآبار المتعددة

1. في اليوم السابق لإعادة الطلاء ، قم بتغطيته ب poly-L-ornithine (PLO). قم بإذابة PLO في ماء معقم لعمل محلول مخزون (10 مجم / مل). قم بتخزين هذا المرق عند -20 درجة مئوية. قم بتخفيف PLO 1: 100 في الماء للحصول على تركيز 50 ميكروغرام / مل عند طلاء الزجاج ونسبة 1: 1,000 (10 ميكروغرام / مل) عند طلاء البلاستيك.
2. ضع الطلاء مباشرة على الألواح المستهدفة. استخدم حجم الطلاء المناسب لحجم اللوحة (على سبيل المثال ، بالنسبة للوحة 24 بئرا ، ضع 500 ميكرولتر من محلول PLO لكل بئر).
3. اسمح للأطباق بالجلوس في الظلام طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
4. استرجع الألواح المطلية في يوم إعادة الطلاء ونقلها إلى خزانة سلامة حيوية معقمة.
5. استنشق محلول منظمة التحرير الفلسطينية واشطفه مرتين بالماء المعقم.
6. تمييع اللامينين (1.15 مجم / مل) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عند 1: 400 تخفيف.
   ملاحظه: قم بإذابة اللامينين عند 4 درجات مئوية وأضفه بسرعة إلى PBS لتجنب تراكم اللامينين والطلاء غير المتساوي.
7. استنشق الماء المعقم وقم بتطبيق 500 ميكرولتر من طلاء اللامينين على الآبار المطلية مسبقا ب PLO.
8. ضع الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 4-6 ساعات على الأقل. استخدم حضانات أطول ، حتى 16 ساعة ، للأسطح الزجاجية. استخدم أوقات حضانة ثابتة.

< p class = "jove_title" >3. إعادة طلاء الخلايا العصبية المتمايزة

1. اشطف لوحة الخلايا العصبية المتمايزة باستخدام PBS مرة واحدة برفق. قم بتفريق PBS برفق أسفل جدار اللوحة ، وليس مباشرة على الخلايا ، لتجنب تعطيلها.
قم
2. بشفط PBS برفق ، مع الحرص على تجنب لمس الخلايا مباشرة ولكن للشفط من حافة الطبق أثناء قلبها نحو الباحث.
3. ضع ما لا يقل عن 1 مل من الإنزيم المحلل للبروتين (جدول المواد) لكل لوحة مقاس 10 سم وأعد الخلايا إلى الحاضنة. أضف كميات أكبر قليلا إذا أظهرت غرفة زراعة الأنسجة معدل تبخر مرتفعا بسبب انخفاض الرطوبة.
4. احتضان الخلايا بإنزيم المحلل للبروتين لمدة 40-45 دقيقة من أجل فصلها عن اللوحة وفصلها عن الخلايا العصبية الأخرى داخل الشبكة العصبية.
   ملاحظه: التوقيت في هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية. يمكن أن يؤدي إخماد البروتياز في وقت مبكر جدا إلى زيادة موت الخلايا بعد إعادة الطلاء. توصي الشركة المصنعة للإنزيم المحلل للبروتين باستخدام درجات حرارة أقل بكثير من 37 درجة مئوية مع فترات حضانة أطول لخطوط الخلايا العابرة (على سبيل المثال ، بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية). ومع ذلك ، يجب تجنب التعامل مع الخلايا العصبية عند 4 درجات مئوية ، لأنها غالبا ما تظهر ضعف البقاء على قيد الحياة بعد التعرض للبرد. تنص الشركة المصنعة أيضا على أن الحضانة لمدة 60 دقيقة مع الإنزيم عند 37 درجة مئوية تؤدي إلى تعطيله الأنزيمي. ومع ذلك ، في تجربة المؤلفين ، فإن حضانة 40-45 دقيقة من الثقافات العصبية المشتقة من hiPSC عند 37 درجة مئوية كافية للتفكك الفعال وبقاء الخلايا العصبية الممتازة عند إعادة الطلاء.
5. افحص الخلايا العصبية على مجهر تباين الطور أثناء وقت الحضانة واسمح للعلاج بالبروتياز بالاستمرار حتى تنفصل الشبكة العصبية تماما عن اللوحة وتبدأ في التفكك إلى صفائح أصغر عند هز اللوحة لفترة وجيزة تحت المجهر.
6. قم بإخماد نشاط البروتياز باستخدام 5 مل من وسائط DMEM الطازجة لكل 1 مل من البروتياز في صفيحة مقاس 10 سم لوقف الهضم. قم بإزالة الخلايا برفق على اللوحة 5-8 مرات لتعطيل الشبكة باستخدام الماصات المصلية. احرص على عدم ممارسة الكثير من الضغط عند التقليب ، لأن الخلايا العصبية المتمايزة هشة. لا تستخدم طرف P1000 ، لأن النهاية حادة جدا وضيقة ، وبالتالي يمكن أن تتسبب في تلف الخلايا العصبية.
7. ضع المحلول مع الخلايا من خلال مصفاة خلوية بشبكة قطرها 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل قطرة قطرة.
8. اشطف المصفاة ب 5 مل إضافية من وسائط DMEM الطازجة ، بعد تصفية الخلايا.
9. قم بتدوير الخلايا في جهاز طرد مركزي على الطاولة عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق.
10. أعد الأنبوب المخروطي إلى خزانة السلامة الحيوية واستنشق معظم الوسائط ، مع ترك حوالي 250 ميكرولتر لضمان احتفاظ الخلايا بالرطوبة.
11. أعد تعليق الخلايا برفق في 2 مل من وسائط DMEM الطازجة. لا تقم بسحب الحبيبات على جانب الأنبوب. بدلا من ذلك ، اقلب الأنبوب المخروطي برفق 2-3 مرات وقم بتمرير الخلايا عبر نهاية ماصة مصلية سعة 5 مل لإخراجها.
12. ضع 10 ميكرولتر من الخلايا العصبية المعلقة على حافة مقياس كثافة الدم.
13. أضف 8-10 ميكرولتر من التريبان الأزرق إلى قطرة الخلايا لتقييم صلاحية الخلية خلال خطوة إعادة التعليق هذه. ضع 10 ميكرولتر من هذا الخليط على مقياس كثافة الدم أو عدادات الخلايا الأوتوماتيكية الأخرى. قم بتقييم تلك الخلايا التي تكون مشرقة على أنها قابلة للحياة واستبعد صبغة التريبان الزرقاء.
14. حدد كمية الخلايا القابلة للحياة / مل ، واستعد لتخفيف محتويات الأنبوب المخروطي وفقا لكثافة الخلية المطلوبة.
15. لوحة ~ 10,000 خلية لكل بئر للوحة 384 بئر ؛ لوحة ~ 150,000-200,000 خلية لكل بئر للوحة 24 بئرا.
16. أضف DMEM جديدا إلى الأنبوب المخروطي للخلايا المعلقة لتحقيق التخفيف المناسب وإضافة مكملات إضافية مناسبة مثل B27 و / أو BDNF ، اعتمادا على متطلبات خط الخلية المحدد.
17. قم بإمالة الأنبوب المخروطي برفق للخلط 2-3 مرات.
18. قم بشفط طلاء اللامينين من اللوحة المكونة من 24 بئرا أو من اللوحة متعددة الآبار المكونة من 384 بئرا باستخدام ماصة ذات 16 قناة واشطفها مرة واحدة باستخدام PBS.
19. قم بشفط PBS باستخدام P1000 للوحة 24 بئرا أو ماصة 16 قناة لألواح 384 بئرا.
20. ضع محلول الخلية على كل بئر بحركة على شكل ثمانية لتجنب التكتل. يمكن أيضا تحسين توحيد الطلاء باستخدام أجهزة معالجة السوائل الآلية.
    ملاحظه: تساعد إضافة اللامينين إلى الوسائط بدءا من 2-4 أيام بعد إعادة الطلاء أيضا في الحفاظ على توزيع متجانس للخلايا.
21. كرر الخطوتين 3.19 و 3.20 لكل بئر.
22. أعد اللوحة إلى الحاضنة ، واضبطها على 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
23. بعد يومين ، ابدأ في تغيير نصف الوسيط كل 4 أيام باستخدام وسائط زراعة ما بعد التمايز الموضحة في القسم 1.2.

المواد