تطوير عضيات العصب الحركي البشري المشتقة من iPSC باستخدام رقاقة الموائع الدقيقة

Abstract

المصدر: Osaki، T.، et al. توليد عضوي للأعصاب الحركية ثلاثية الأبعاد. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو طريقة إنشاء عضيات الأعصاب الحركية عن طريق زراعة الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية أولا في وسط خاص لتشكيل كرويات ، ثم تمييزها إلى خلايا عصبية حركية باستخدام مثبطات محددة ، وأخيرا زراعتها في شريحة ميكروسويدية لتمديد المحاور وتشكيل عضيات الأعصاب الحركية.

Protocol

فئة

1. تصنيع قالب SU-8 بواسطة الطباعة الحجرية

الضوئية

ملاحظة: يتضمن هذا الإجراء مواد كيميائية خطرة. استخدم غطاء الدخان ومعدات الوقاية الشخصية طوال الوقت.

1. نظف رقاقة السيليكون (قطرها 4 بوصات ، سمك 1 مم ، مصقول) بالأسيتون وانفخ بغاز النيتروجين. ثم اخبزيها على حرارة 180 درجة مئوية لمدة 3 دقائق حتى تجف.
2. ضعي 3 مل من SU-8 2100 على رقاقة نظيفة.
3. قم بتغطية SU-8 بشكل موحد على الرقاقة باستخدام طلاء تدور عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان ثم قم بالدوران بالتتابع عند 1500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية بتسارع 300 دورة في الدقيقة / ثانية للحصول على طبقة سميكة 150 ميكرومتر من SU-8.
   ملاحظة: تأكد من وضع رقاقة السيليكون في وسط آلة طلاء الدوران وتثبيتها بشكل صحيح بواسطة الفراغ.
4. تخبز الرقاقة على الطبق الساخن على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، عند 65 درجة مئوية لمدة 7 دقائق ، وعند 95 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
5. اضبط القناع الضوئي (الشكل 1) على محاذاة القناع وكشف ضوء الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر) لمدة 60 ثانية < / > ملاحظة: يجب تحسين وقت التعرض بجرعة مناسبة من ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
6. بعد التعرض ، اخبزي الرقاقة على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 6 دقائق ، وعلى حرارة 95 درجة مئوية لمدة 13 دقيقة على الطبق الساخن.
7. قم بتطوير الرقاقة لمدة 10-20 دقيقة في مطور SU-8 مع التحريك باستخدام شاكر مداري ، وتغيير المحلول المطور مرة واحدة أثناء العملية.
   ملاحظة: قم بتمديد وقت التطوير عندما يظل حطام SU-8.
8. اشطف الرقاقة في الأيزوبروبانول وجفف الرقاقة برفق بغاز النيتروجين.
9. قم بقياس ارتفاع SU-8 المودع بواسطة مجهر قياس وتأكد من سمكه حوالي 150 ميكرومتر. يمكن تخزينه إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة.

< p class = "jove_title" >2. Polydimethylsiloxane (PDMS) تصنيع رقاقة ثقافة الأنسجة القائمة على الموائع الدقيقة

1. ثبت الرقاقة المودعة SU-8 في حاوية (على سبيل المثال ، طبق بتري بلاستيكي مقاس 15 سم) بواسطة شريط على الوجهين.
2. انفخ الغبار عن الرقاقة باستخدام غاز النيتروجين.
3. للسيلان ، ضع الرقاقة المودعة SU-8 في غرفة مفرغة مع وعاء صغير (على سبيل المثال ، طبق 35 مم). قم بإسقاط 10 ميكرولتر من (ثلاثي الفلور -1،1،2،2-رباعي هيدروأوكتيل) -1-ثلاثي كلورو سيلان في الحاوية الصغيرة. لا تضع مباشرة (ثلاثي فلورو-1،1،2،2-رباعي هيدروأوكتيل)-1-ثلاثي كلوروسيلان على رقاقة SU-8.
4. أغلق غرفة التفريغ بإحكام وقم بتشغيل مضخة التفريغ لمدة 2 ساعة على الأقل.
5. خذ كوبا بلاستيكيا واسكب المطاط الصناعي السيليكوني (على سبيل المثال ، Silpot 184 أو ما يعادله ، Sylgard 184) وعامل المعالجة بنسبة وزن 10: 1. ثم اخلطي جيدا باستخدام ملعقة وإزالة الغازات في غرفة التفريغ حتى تتم إزالة الفقاعات تماما.
6. صب خليط PDMS في الحاوية مع رقاقة SU-8 إلى السماكة المطلوبة (3-4 مم) وإزالة الغاز مرة أخرى لإزالة الفقاعات.
7. تخبز PDMS في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات على الأقل لمعالجة PDMS بالكامل.
8. بعد التبريد ، قم بقطع PDMS المعالج من الرقاقة باستخدام مشرط أو شفرة حلاقة.
9. لإنشاء غرفتي رقاقة زراعة الأنسجة ، قم بعمل فتحتين حيث توجد الجزأين باستخدام لكمة خزعة قطرها 1.5 مم.
10. لإنشاء خزان متوسط ، قم بإعداد خليط PDMS آخر (مطاط السيليكون وعامل المعالجة بنسبة وزن 10: 1) واسكبه في طبق بتري جديد مقاس 10 سم. اضبط حجم الصب على 5 مم من سمك PDMS.
11. تخبز PDMS في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات على الأقل لمعالجة PDMS بالكامل.
12. بعد تبريد PDMS ، قم بقطع PDMS المعالج بمشرط للحصول على حلقة مستطيلة.
13. اربط الطبقة السفلية بالخزان المتوسط عن طريق تطبيق PDMS غير المعالج بينهما وخبز طبقات PDMS المجمعة. ينتج عن هذا الهيكل المستعبدين رقاقة زراعة الأنسجة PDMS.
14. قم بتنظيف شريحة زراعة الأنسجة PDMS بواسطة شريط سكوتش لإزالة الغبار والجزيئات الصغيرة من السطح. يمكن تخزين رقائق زراعة الأنسجة PDMS في درجة حرارة الغرفة إذا كانت محمية من الغبار والأشعة فوق البنفسجية.

< ص الفئة = "jove_title" >3. إعداد الثقافة

1. وسيط الثقافة
   ملاحظه: يجب تصفية جميع الوسائط المدرجة أدناه للتعقيم ما لم ينص على خلاف ذلك. يمكن تخزين الوسائط المحضرة عند 4 درجات مئوية واستخدامها في غضون شهر.
   1. لتحضير mTeSR Plus المتوسط: امزج زجاجة واحدة من 100 مل mTeSR Plus 5x مع زجاجة واحدة سعة 400 مل من mTeSR Plus Basal Medium.
   2. لتحضير 100 مل من وسط KSR: في 85 مل من Dulbecco's Modified Eagle Medium أو DMEM / F12 ، أضف 15 مل من بدائل مصل Knockout (KSR ، 15٪) ، 1 مل من مكمل الجلوتامين التجاري (1٪) و 1 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA ، 1٪).
   3. لتحضير 100 مل من وسط N2: في 100 مل من الوسط العصبي القاعدي ، أضف 1 مل من N2 (100x) ، و 1 مل من مكمل الجلوتامين التجاري ، و 1 مل من NEAA.
   4. لتحضير 250 مل من وسط النضج: في 250 مل من الوسط العصبي القاعدي ، أضف 5 مل من B27 (2٪) ، و 2.5 مل من مكملات الجلوتامين التجارية (1٪) ، و 2.5 مل من البنسلين / الستربتومايسين (1٪).
   5. أعد تعليق المركبات (حمض الريتينويك (RA) ، SB431542 ، LDN-193189 ، SU5402 ، DAPT ، SAG ، Y-27632) في DMSO من فئة زراعة الخلايا إلى التركيز المطلوب. قم بإعداد الحصص وتخزينها عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. يتم استخدام حلول المخزون التالية: 1 ملي روماتيك ، 10 ملي SB431542 ، 100 ميكرومتر LDN-193189 ، 10 ملي مولار SU5402 ، 10 ملي مولار DAPT ، 1 ملي مولار SAG ، 10 ملي مولار Y-27632.
2. طلاء
   ملاحظه: لمنع بلمرة مصفوفة الغشاء القاعدي بالحرارة ، تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. تعامل مع جميع إجراءات الطلاء باستخدام أطراف وأنابيب الماصة المبردة مسبقا إن أمكن. يجب إذابة مصفوفة الغشاء القاعدي طوال الليل عند 4 درجات مئوية وتقسيبها باستخدام أطراف وأنابيب الماصة المبردة مسبقا. يمكن تجميد الكميات عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية.
   1. قم بإذابة كمية الجمدة عند 4 درجات مئوية على الجليد. يجب أن تبقى الكمية باردة أثناء إجراء الطلاء. باستخدام طرف ماصة مبرد مسبقا، قم بتخفيف مصفوفة الغشاء القاعدي باستخدام DMEM/F12 المثلج بنسبة 1:40. يمكن تخزين مصفوفة الغشاء القاعدي المخففة غير المستخدمة عند 4 درجات مئوية لمدة 2-3 أيام ، نظرا لعدم حدوث بلمرة.
   2. أضف 1 مل من مصفوفة الغشاء القاعدي / محلول DMEM-F12 لتغطية بئر واحد من اللوحة المكونة من 6 آبار.
   3. احتضان الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة على الأقل ، أو 4 درجات مئوية طوال الليل. يمكن تخزين الألواح المطلية عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد كحد أقصى.

4. صيانة خلايا iPS

1. قم بإعداد أطباق مغلفة بمصفوفة غشاء القاعدي كما هو مذكور سابقا في الخطوة 3.2.
2. استنشق كامل متوسط mTeSR Plus. اغسل البئر مرة واحدة باستخدام PBS وأضف 0.5 مل من كاشف المرور (انظر جدول المواد). انتظر بضع ثوان واستنشق المحلول.
3. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في الحاضنة لمدة 5 دقائق أو حتى تصبح الخلايا مستديرة.
   ملاحظه: قد يختلف وقت الحضانة بين خطوط خلايا iPS المختلفة والتقاء. يرجى التحقق بشكل دوري تحت المجهر لتحديد وقت التفكك أثناء الحضانة.
4. أضف 1 مل من mTeSR Plus المتوسطة واضغط على اللوحة لمدة 30-60 ثانية لفصل المستعمرات.
5. امزج برفق 1 مل من محلول تعليق الخلية مع 7 مل من mTeSR الطازج بالإضافة إلى المتوسط. لا تقم بالماصة أكثر من 5 مرات.
6. لوحة بنسبة 1: 8. عادة ما تضيف 1 مل من المعلق من الخطوة 5.5 وأضف 1 مل من mTeSR بالإضافة إلى الوسائط المكملة ب 5-10 ميكرومتر من Y-27632 (مثبط ROCK). نسبة تخفيف المرور يعتمد على خط iPSC.
7. ضع الخلية في حاضنة 5٪ CO2 / 37 °C. في اليوم التالي ، قم بإزالة Y-27632 عن طريق إضافة وسيط mTeSR Plus الجديد. بعد ذلك ، قم بتغيير الوسائط كل يومين في البداية ، وكل يوم عندما تصل الخلية إلى التقاء أعلى.

فئة

5. تمايز خلايا iPS إلى خلايا عصبية حركية

1. عابر iPSC لتمايز الخلايا العصبية الحركية
   ملاحظه: يمكن إجراء التمايز بنجاح في بروتوكول 3D (5.2).
   1. اسمح لخلايا iPS غير المتمايزة بالنمو حتى تصل إلى التقاء حوالي 80٪ في وسط mTeSR Plus في صفيحة من 6 آبار.
   2. استنشق الوسط تماما. اغسل البئر على الفور مرة واحدة باستخدام PBS المعقم وأضف 0.5 مل من محلول تفكك الخلايا إلى الخلايا.
   3. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في الحاضنة لمدة 2-3 دقائق تقريبا ، أو حتى تنفصل الخلايا وتستدير ولكنها تظل ملتصقة بالبئر.
   4. أضف 1 مل من الماصة المتوسطة وبرفق لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل يتكون من 4 مل من الوسط.
   5. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 3 دقائق.
   6. قم بشفط المادة الطافية بعناية ، واترك الحبيبات دون إزعاج ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من الوسط المكمل ب 10 ميكرومتر من Y-27632.
   7. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم وانتقل إلى 5.2 (تمايز ثلاثي الأبعاد).
2. تشكيل الخلايا العصبية الحركية الكروية (MNS) في التمايز ثلاثي الأبعاد ("بروتوكول 3D")
   ملاحظه: يتم إجراء تغيير متوسط كامل يوميا من الأيام 0-12 من التمايز (الشكل 2).
   1. قم بزرع خلايا iPS من الخطوة 5.1.7 إلى صفيحة سفلية بحجم 96 بئر عند 40,000 خلية / بئر في 100 ميكرولتر من mTeSR Plus مكملة ب 10 ميكرومتر من Y-27632.
   2. في اليوم التالي ، استبدل كل بئر ب 100 ميكرولتر من الوسط الطازج.
   3. في اليومين 0 و 1: استنشق وسط الاستزراع واستبدله ب 100 ميكرولتر من وسط KSR (3.1.2) مكمل ب 10 ميكرومتر SB431542 و 100 نانومتر LDN-193189.
   4. في اليومين 2 و 3: استنشاق وسط الاستزراع واستبدله ب 100 ميكرولتر من وسط KSR مكمل ب 10 ميكرومتر SB431542 ، 100 نانومتر LDN-193189 ، 5 ميكرومتر DAPT ، 5 ميكرومتر SU5402 ، 1 ميكرومتر RA و 1 ميكرومتر SAG.
   5. في اليومين 4 و 5: تحضير وسط مختلط يتكون من 75٪ KSR متوسط و 25٪ N2 متوسط (3.1.3). بعد ذلك ، قم بشفط وسط الاستزراع واستبدله ب 100 ميكرولتر من الوسط المختلط المكمل ب 10 ميكرومتر SB431542 ، 100 نانومتر LDN-193189 ، 5 ميكرومتر DAPT ، 5 ميكرومتر SU5402 ، 1 ميكرومتر RA ، و 1 ميكرومتر SAG.
   6. في اليومين 6 و 7: تحضير وسط مختلط يتكون من 50٪ KSR متوسط و 50٪ N2 متوسط. بعد ذلك ، قم بشفط وسط الاستزراع واستبدله ب 100 ميكرولتر من الوسط المختلط المكمل ب 5 ميكرومتر DAPT و 5 ميكرومتر SU5402 و 1 ميكرومتر من حمض الريتينويك و 1 ميكرومتر SAG.
   7. في اليومين 8 و 9: تحضير وسط مختلط يتكون من 25٪ KSR متوسط و 75٪ N2 متوسط. ثم يتم شفط وسط الاستزراع واستبداله ب 100 ميكرولتر من الوسط المختلط المكمل ب 5 ميكرومتر DAPT و 5 ميكرومتر SU5402 و 1 ميكرومتر RA و 1 ميكرومتر SAG.
   8. في اليومين 10 و 11: يستعاض عن الوسط ب 100 ميكرولتر من وسط N2 مكمل ب 5 ميكرومتر DAPT و 5 ميكرومتر SU5402 و 1 ميكرومتر RA و 1 ميكرومتر SAG.
   9. في اليوم 12: تابع نقل MNs إلى شريحة زراعة الأنسجة (الخطوة 6) أو استبدل الوسط ب 100 ميكرولتر من وسط النضج (3.1.4) مكملا ب 20 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF).
      ملاحظه: يمكن نقل MNS إلى شريحة زراعة الأنسجة بدءا من اليوم 12 حتى اليوم 19. يجب أن تبقى الكرات الكروية التي لم يتم نقلها مستزرعة في 96 بئر U صفيحة سفلية في وسط النضج مع 20 نانوغرام / مل BDNF حتى النقل.

< p class = "jove_title" >6. تحضير رقاقة زراعة الأنسجة لتكوين العصب الحركي العضوي (MNO)

1. قم بتعقيم PDMS المحضر (من الخطوة 2.13) عن طريق غمره في 70٪ من الإيثانول في طبق بتري لمدة 1 ساعة على الأقل < br / > ملاحظه: يجب التلاعب بجميع الخطوات التالية في خزانة السلامة البيولوجية.
2. عقم زجاج المجهر (76 × 52 مم) عن طريق غمره في 70٪ من الإيثانول في طبق بتري.
3. أثناء عملية تجفيف زجاج المجهر ، ضع جهاز PDMS على زجاج نصف مجهر مبلل واتركه يجف تماما عن طريق الانتظار طوال الليل. بمجرد أن يجف تماما ، يجب أن يلتصق جهاز PDMS بالزجاج.
   ملاحظه: هذا الترابط ليس دائما للسماح بفصل أجهزة PDMS عن زجاج المجهر بعد زراعة جمع الأنسجة. يمكن استخدام الترابط الدائم بواسطة بلازما الأكسجين لزيادة الالتصاق بين PDMS والزجاج ، ولكنه يحظر تفكيك الرقائق وجمع الأنسجة.
4. قم بتغطية سطح القناة الدقيقة بجهاز PDMS وزجاج المجهر ب 30 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي المخفف في DMEM / F12 (1:40) عن طريق عمل قطرة على جانب واحد من مدخل القناة ثم شفط المحلول من الجانب الآخر من المدخل باستخدام ماصة أو مضخة شفط (الشكل 3 أ). لا تستنشق كمية كبيرة من المحلول لتجنب تلوث الفقاعات.
5. بعد ذلك ، احتضن جهاز PDMS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية في حاوية ثانوية (على سبيل المثال ، طبق بتري).

< p class = "jove_title" >7. تكوين العضوية العصبية الحركية (MNO)

1. استبدل محلول الطلاء ب 150 ميكرولتر من وسط النضج المسخن مسبقا مع 20 نانوغرام / مل من BDNF قبل الاستخدام مباشرة.
2. بعد ذلك، ضع MNS من الخطوة 5.2.9 في مدخل القناة الدقيقة باستخدام ماصة دقيقة ذات طرف عريض التجويف. يمكن أن تستقر MNS تلقائيا في الجزء السفلي من الجهاز عن طريق الجاذبية. لا تضغط كثيرا عند حقن MNS (الشكل 3 ب).
   ملاحظه: إذا كان MNS عالقا على الجدار الجانبي لثقب في شريحة زراعة الأنسجة ، فقم بشفط المحلول برفق من جانب آخر من المدخل.
3. املأ خزانا صغيرا (على سبيل المثال ، غطاء من أنبوب 15 مل) بالماء المعقم وضعه بالقرب من شريحة زراعة الأنسجة في الحاوية الثانوية لمنع التبخر المتوسط. ثم ضعه في حاضنة 5٪ CO2 / 37 °C.
4. للحصول على تغيير متوسط ، قم بشفط وسط الاستزراع المستنفد من مركز الخزان المتوسط (الشكل 3 ج). لا تستنشق كل الوسط والأنسجة.
5. أضف وسط النضج الطازج برفق (مع BDNF). يجب تغيير الوسيط كل 2-3 أيام. لا تجفف وسط الثقافة في أي وقت أثناء الزراعة. تنمو المحاور من MNS إلى القناة وتتجمع تلقائيا في حزمة واحدة في غضون 2-3 أسابيع ، مما يؤدي إلى تكوين MNO. يمكن استزراع MNO لأكثر من شهر إضافي في الجهاز.

Results

الشكل 1: أبعاد رقاقة زراعة الأنسجة PDMS.

< p class = "jove_content" > (أ) قناع ضوئي لشريحة زراعة الأنسجة. (ب) أبعاد القناة الدقيقة في رقاقة زراعة الأنسجة. يبلغ قطر حجرة القاعدة لعقد الخلايا العصبية الحركية الكروية 2 مم وثقب PDMS فوق الغرفة 1.5 مم. يبلغ عرض وارتفاع القناة الدقيقة التي تربط بين غرفتين 150 ميكرومتر.

Materials