$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. مزارع الخلايا والتمايز المسبق
- زراعة الخلايا الجذعية العصبية والتمايز المسبق
- قم بإعداد أغطية مطلية ب poly-D-lysine. ضع غطاء معقم (قطره 20 مم) في طبق من 12 بئرا. قم بتغطية زجاج الغطاء ب poly-D-lysine ، 0.1٪ وزن / حجم ، في الماء لتحسين التصاق الخلايا على الغطاء باتباع الخطوات التالية.
ملاحظة: يجب تحديد الظروف المثلى لكل خط خلية وتطبيق.
- قم بتغطية سطح الغطاء بشكل معقم ب poly-D-lysine ، 0.1٪ وزن / حجم ، في الماء. قم بالصخور برفق لضمان طلاء متساو لسطح الغطاء.
- بعد الزراعة بين عشية وضحاها (~ 12 ساعة) عند 37 درجة مئوية ، قم بإزالة محلول poly-D-lysine وشطف السطح 3x ب 1 مل من الماء المعقم.
- جفف الخلايا لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل بذرها.
- مزرعة الخلايا الجذعية العصبية للفئران C17.2 (C17.2-NSC) والتمايز المسبق
- احتضان C17.2-NSCs في قارورة 2 مقاس 25 سم في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 10٪ مصل بقري جنين (FBS) ، و 5٪ مصل حصان (HS) ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ل ~ 2 - 3d.
- عندما تصل الخلايا إلى 85٪ من التقاء ، قم بإزالة الوسط ، واغسل الخلايا ب 1 مل من PBS ، وأضف 1 مل من التربسين الطازج (0.25٪) في القارورة. اتركه لمدة 1 دقيقة ؛ بعد ذلك ، أضف 1 مل من وسط الاستزراع إلى القارورة والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لضمان تعليق خلية واحدة.
- احسب كثافة الخلايا في المعلق باستخدام مقياس كثافة الدم. احسب الحجم المطلوب لتعليق الخلية لإعطاء تركيز خلية نهائي يبلغ 2 × 104 خلايا / مل.
- قم بزرع C17.2-NSCs على الطبقات المطلية في الصفيحة المكونة من 12 بئرا بكثافة ~ 2 × 104 خلايا لكل بئر. تحقق من كثافة الخلية تحت المجهر.
ملاحظة: للحصول على نتيجة أفضل ، يجب تحديد كثافة الخلايا المثلى قبل تجربة التألق المناعي.
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة خلية لمدة 12 ساعة للسماح بالتوصي.
- بعد التعلق ، اغسل الخلايا 2x مع 1 مل من PBS وقم بزراعة الخلايا بوسط تمايز يتكون من DMEM / F12 مع مكمل N2 1٪ لمدة 48 ساعة قبل العلاج بالبلازما.
- زراعة الخلايا الجذعية العصبية الأولية للفئران والتمايز المسبق
- استزراع تعليق NSC الأولي للفئران (الخلايا الجذعية العصبية) في وسط نمو NSC للفئران في قوارير T25 غير مطلية بكثافة 5 × 105 خلايا.
- تحقق من تكوين المجالات العصبية تحت المجهر المقلوب. تأكد من أن مورفولوجيا المجالات العصبية تظهر مجمعات كروية وشفافة متعددة الخلايا.
- عندما يصل قطر المجالات العصبية إلى 3 مم أو أكبر ، انقل تعليق الغلاف العصبي إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل واترك المجالات العصبية تستقر عن طريق الجاذبية.
- قم بإزالة المادة الطافية بعناية لترك المجالات العصبية في الحد الأدنى من المتوسط.
- اشطف المجالات العصبية 1x مع 5 مل من PBS واترك المجالات العصبية تستقر عن طريق الجاذبية. قم بإزالة المادة الطافية لترك حجم ضئيل من PBS.
- أضف حجما مناسبا من وسط التمايز لضبط كثافة الخلية إلى ~ 12 - 15 من المجالات العصبية لكل مليلتر. يتكون وسط التمايز لمراكز NSCs الأولية للفئران من DMEM / F12 و 2٪ B27 و 1٪ FBS.
- بذرة 1 مل من تعليق الغلاف العصبي على كل غطاء مغلف في اللوحة المكونة من 12 بئر.
ملاحظة: رج الطبق برفق للتأكد من توزيع المجالات العصبية بالتساوي. هذه الخطوة ضرورية للحصول على نتيجة أفضل للتألق المناعي.
- ضع اللوحة في الحاضنة واتركها تتمايز مسبقا لمدة 24 ساعة قبل معالجة البلازما.
< p class = "jove_title" >
2. تحضير نفاثات البلازما
- اختر أنبوب كوارتز نصف مفتوح بقطر داخلي 2 مم وقطر خارجي 4 مم. أدخل سلكا عالي الجهد بقطر 2 مم في الأنبوب.
- أدخل أنبوب الكوارتز بسلك الجهد العالي في حقنة سعة 5 مل واستخدم حاملا لتثبيته داخل وسط المحقنة. اضبط المسافة بين الطرف المغلق لأنبوب الكوارتز وطرف المحقنة عند 1 سم.
- قم بتوصيل أنبوب مطاطي سيليكون بطول 1 متر (بقطر داخلي 12 مم) بالطرف المفتوح للحقنة ثم قم بتوصيله بمقياس التدفق وصمام الغاز بالتسلسل.
< p class = "jove_title" >
3. الاستحواذ على الطائرات
- قم بتوصيل الدائرة كما هو موضح في الشكل 1. قم بتوصيل سلك الإخراج الخاص بمصدر الطاقة بجهاز نفث البلازما ثم قم بتوصيل طرف مسبار الجهد العالي بسلك الإخراج للكشف عن الجهد. قم بتوصيل الطرف الآخر من مسبار الجهد العالي براسم الذبذبات لتسجيل معلومات جهد الإخراج. تحقق من الدائرة بأكملها وتأكد من تأريض مصدر الطاقة وراسم الذبذبات ومسبار الجهد العالي.
- تحقق من خط الغاز. تأكد من توصيل أنبوب الغاز بجهاز نفاثة البلازما ؛ بعد ذلك ، افتح صمام الغاز للهيليوم (كسر الحجم ، 99.999٪) والأكسجين (كسر الحجم ، 99.999٪) واضبط تدفق الغاز على 1 لتر: 0.01 لتر / دقيقة (He: O2).
ملاحظة: دع الغاز يتدفق لعدة دقائق قبل تشغيل مصدر الطاقة لأول مرة.
- اضبط سعة النبضة والتردد وعرض النبضة على 8 كيلو فولت و 8 كيلو هرتز و 1600 نانوثانية على التوالي. تحقق من الدائرة مرة أخرى وبعد ذلك ، قم بتشغيل زر الإخراج لإنشاء نفاثة البلازما.
تنبيه: لا تلمس سلك الجهد العالي في أي وقت.
< p class = "jove_title" >
4. علاج البلازما للخلايا الجذعية العصبية
- اضبط المسافة بين فوهة المحقنة وفتحة بئر الخلية على 15 مم.
ملاحظة: يتم قياس المسافة من أسفل المنصة حيث يتم وضع اللوحة المكونة من 12 بئرا.
- أخرج الصفيحة المكونة من 12 بئرا من الحاضنة وقم بتغيير وسط الخلايا المتمايزة مسبقا إلى 800 ميكرولتر من وسط التمايز الجديد.
- قسم الخلايا إلى ثلاث مجموعات: مجموعة تحكم غير معالجة ، ومجموعة معالجة تدفق الغاز 60 ثانية He-and-O2 (1٪) ، ومجموعة معالجة البلازما 60 ثانية.
ملاحظة: لا يوجد فقدان واضح للسوائل في ظل حالة العلاج.
- ضع اللوحة المكونة من 12 بئرا تحت نفاثات البلازما ، وتأكد من تثبيت فوهة المحقنة في وسط كل ثقب ، وأعط المعالجة ذات الصلة للمجموعات المختلفة المذكورة في الخطوة 4.3.
ملاحظة: تم الاحتفاظ بالضوابط غير المعالجة في وسط تمايز في درجة حرارة الغرفة أثناء الإجراء التجريبي لضمان ظروف معالجة موحدة. تم التعامل مع مجموعة معالجة تدفق الغاز He-and-O2 (1٪) بتدفق غاز He و O2 (1٪) فقط ، دون توليد البلازما. يجب إجراء جميع العلاجات في ثلاث نسخ.
< p class = "jove_title" >
5. تمايز الخلايا الجذعية العصبية
- بعد العلاج ، قم بإزالة الثقافة الأصلية وأضف 1 مل من وسط التمايز الجديد إلى كل بئر.
- احتضان الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 6 د. قم بتغيير الوسط كل يومين.
- تحقق من حالة التمايز للمجموعات المختلفة يوميا تحت مجهر ضوئي مقلوب بتباين الطور الشكل 2. حدد بشكل عشوائي ما لا يقل عن 12 حقلا والتقط صورا لتسجيل التغييرات المورفولوجية.
