توليد سلائف الخلايا العصبية الداخلية القشرية من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر

الملخص

المصدر: Tischfield، D.J.، et al تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر إلى سلائف الخلايا العصبية الداخلية القشرية. J. Vis. Exp. (2017)

يقدم هذا الفيديو طريقة لتوليد سلائف الخلايا العصبية الداخلية القشرية من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر. يستلزم البروتوكول زراعة الخلايا الجذعية في وسائط تحتوي على مثبطات جزيئات صغيرة محددة ، مما يسهل تكاثر الخلايا الجذعية وتجميعها في أجسام جنينية (EBs). بعد ذلك ، يتم فصل EBs عن الإنزيمات وطلاءها على آبار لوحة الاستزراع المغلفة ببروتينات الالتصاق لتعزيز تمايزها إلى سلائف الخلايا العصبية القشرية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. إعداد الوسائط

ملاحظة: قم بتسخين جميع الوسائط إلى 37 &# 176 ؛ ج قبل الاستخدام في زراعة الخلايا.

1. وسائط الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEF) (لتحضير 500 مل)
   1. أضف 50 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) إلى 449 مل من Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ، وقم بالتصفية من خلال وحدة تصفية المسام سعة 500 مل 0.22 ميكرومتر.
   2. أضف 1 مل من عامل مضاد للميكروبات (50 مجم / مل) بعد الترشيح. قم بتخزين الوسائط في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد أو تخزينها في درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية.
2. وسائط N2 (لتحضير 500 مل)
   1. أضف 5 مل من L-alanin....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الخلايا الليفية الجنينية للفأر (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem جي اس سي-6101 جي 1 قارورة من 7M MEFs تكفي لأربع ألواح TC مقاس 10 سم. FBS أتلانتا بيولوجيكس S11150H بريموسين إنفيفوجين النمل PM-2 يعرف أيضا باسم العامل المضاد للميكروبات. لا تقم بالتصفية باستخدام الوسائط الأساسية - أضفها بعد الترشيح. ملحق N2 - ب تقنيات الخلايا الجذعية 7156 لا تقم بالتصفية باستخدام الوسائط الأساسية - أضف بعد الترشيح جلوتاماكس (100x) ثيرموفيشر 35050061 يعرف أيضا باسم L-alanine-L-glutamine. استبدال مصل خروج المغلوب (KSR) ثيرموفيشر 10828028 يعرف أيضا باسم المكملات الغذائية المتوسطة الخالية من المصل. L-جلوتامين (100x) ثيرموفيشر 25030081 MEM-NEAA (100x) ثيرموفيشر 11140050 2-ميركابتو إيثانول ثيرموفيشر 21985023 خروج المغلوب DMEM ثيرموفيشر 10829018 Hyclone FBS VWR 82013-578 يعرف أيضا باسم FBS من الدرجة الجذعية. طبق معالج بزراعة الأنسجة (10 سم) بي دي فالكون 353003 طبق بتري معقم غير ملتصق (10 سم) VWR هاتف: 25384-342 العامل المثبط لسرطان الدم (mLIF) كيميكون ESG1107 لا تجمد ، قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجة مئوية. DMEM / F12 ثيرموفيشر 11330032 0.1٪ محلول جيلاتين ATCC ATCC PCS-999-027 لامينين سيغما L2020 بولي إل ليسين سيغما ص 6282 التربسين EDTA (0.05٪) ثيرموفيشر 25300054 أكوتاز ثيرموفيشر A1110501 يعرف أيضا باسم كاشف تفكك الخلايا غير التربسين. RQ1 DNase خال من RNase بروميجا M610A LDN-193189 ستيمجنت 04-1974 قم بالتعليق في DMSO وتخزينه عند -80 درجة مئوية في حصص الاستخدام الفردي XAV939 ستيمجنت 04-1946 قم بالتعليق في DMSO وتخزينه عند -80 درجة مئوية في حصص الاستخدام الفردي مثبط الصخور (Y-27632) توكرس 1254 قم بالتعليق في DMSO وتخزينه عند -80 درجة مئوية في حصص الاستخدام الفردي