توليد سلائف الخلايا العصبية الداخلية القشرية من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر

الملخص

المصدر: Tischfield، D.J.، et al تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر إلى سلائف الخلايا العصبية الداخلية القشرية. J. Vis. Exp. (2017)

يقدم هذا الفيديو طريقة لتوليد سلائف الخلايا العصبية الداخلية القشرية من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر. يستلزم البروتوكول زراعة الخلايا الجذعية في وسائط تحتوي على مثبطات جزيئات صغيرة محددة ، مما يسهل تكاثر الخلايا الجذعية وتجميعها في أجسام جنينية (EBs). بعد ذلك ، يتم فصل EBs عن الإنزيمات وطلاءها على آبار لوحة الاستزراع المغلفة ببروتينات الالتصاق لتعزيز تمايزها إلى سلائف الخلايا العصبية القشرية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. إعداد الوسائط

ملاحظة: قم بتسخين جميع الوسائط إلى 37 &# 176 ؛ ج قبل الاستخدام في زراعة الخلايا.

1. وسائط الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEF) (لتحضير 500 مل)
   1. أضف 50 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) إلى 449 مل من Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ، وقم بالتصفية من خلال وحدة تصفية المسام سعة 500 مل 0.22 ميكرومتر.
   2. أضف 1 مل من عامل مضاد للميكروبات (50 مجم / مل) بعد الترشيح. قم بتخزين الوسائط في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد أو تخزينها في درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية.
2. وسائط N2 (لتحضير 500 مل)
   1. أضف 5 مل من L-alanine-L-glutamine (100x) و 500 ميكرولتر 2-Mercaptoethanol (55 مل) إلى 489.5 مل DMEM: خليط المغذيات F-12 (DMEM / F-12) ، وقم بالتصفية من خلال وحدة تصفية المسام سعة 500 مل 0.22 ميكرومتر.
   2. أضف 1 مل من العامل المضاد للميكروبات (50 ملغم/مل) و5 مل من مكمل N2 ب بعد الترشيح. قم بتخزين الوسائط في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى شهر واحد.
3. وسط نمو خال من المصل (KSR) (لتحضير 500 مل)
   1. أضف 75 مل من المكملات الغذائية المتوسطة الخالية من المصل ، و 5 مل من L-glutamine (100x) ، و 5 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (MEM-NEAA) (100x) ، و 500 ميكرولتر 2-Mercaptoethanol (55 مل) إلى 413.5 مل من DMEM غير الجلوتامين ، وقم بالتصفية من خلال وحدة تصفية المسام سعة 500 مل 0.22 ميكرومتر.
   2. أضف 1 مل من عامل مضاد للميكروبات (50 مجم / مل) بعد الترشيح. قم بتخزين الوسائط في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
4. وسائط الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (لتحضير 500 مل)
   1. أضف 75 مل من الخلايا الجذعية FBS ، و 5 مل MEM-NEAA (100x) ، و 5 مل L-glutamine (100x) ، و 500 ميكرولتر 2-Mercaptoethanol (55 مل) إلى 413.5 مل غير الجلوتامين المحتوي على DMEM ، وقم بالترشيح من خلال وحدة تصفية المسام 500 مل 0.22 ميكرومتر.
   2. أضف 1 مل من عامل مضاد للميكروبات (50 مجم / مل) بعد الترشيح. قم بتخزين الوسائط في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى شهر واحد أو تخزينها في درجة حرارة ≤ -20 درجة مئوية.

2. استزراع mESCs

1. قم بلوحة خلايا التغذية MEF غير النشطة انقساميا في وسائط MEF على ألواح معالجة بزراعة الأنسجة عند 3-4 × 10⁴ خلايا / سم². اترك 12 ساعة على الأقل حتى يستقر في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع رطوبة نسبية ≥ 95٪ و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ قبل طلاء mESCs. إذا لم يتم استخدامها على الفور ، فاستبدل وسائط MEF كل 3 أيام. تخلص من MEFs إذا لم يتم استخدامها في غضون 7 أيام من الطلاء.
2. أضف mESCs (تتراوح الكثافة من 1-4 × 10⁴ خلايا / سم²) إلى لوحات MEF في وسائط mESC التي تحتوي على عامل مثبط لسرطان الدم في الفأر (mLIF) (1,000 وحدة / مل). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع رطوبة نسبية ≥ 95٪ و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
3. قم بتمرير mESCs باستخدام التربسين-EDTA (0.05٪ تربسين) (1: 5-1: 10) بمجرد أن يصبح الطبق ~ 70-80٪ ملتقى أو إذا بدأت المستعمرات في اللمس. يحدث هذا عادة كل يومين ولكن يمكن أن يستغرق ما يصل إلى 4 أو 5 أيام ، اعتمادا على كثافة الطلاء الأولية.
4. حافظ على mESCs على طبقة تغذية MEF في وسط mESC للحفاظ على تعدد القدرات.
5. قبل البدء في التمايز ، قم بتمرير الخلايا مرة واحدة على الأقل على ألواح مغلفة بالجيلاتين بدون MEFs لتخفيف MEFs.​
   1. قم بإعداد ألواح مغلفة بالجيلاتين عن طريق إضافة 0.1٪ جيلاتين في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع Ca^{2 +} / Mg²⁺ إلى طبق معالج بزراعة الأنسجة وتركه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. لوحة 1.5-2 × 10⁶ خلايا / صفيحة 10 سم (2.7-3.6 × 10⁴ خلايا / سم²) والسماح للخلايا بالتمدد لمدة يومين قبل بدء التمايز.

< p class = "jove_title" >3. التمييز بين mESCs نحو أسلاف الدماغ الشبيهة ب MGE

1. يوم التمايز (DD) 0 = "الخلايا العائمة"
   1. بعد أن تنمو mESCs على ألواح مغلفة بالجيلاتين لمدة يومين ، قم بشفط الوسائط واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS بدون Ca^{2 +} / Mg²⁺. أضف ما يكفي من التربسين-EDTA (0.05٪ تريبسين) لتغطية سطح اللوحة (عادة 4 مل من التربسين-EDTA لطبق واحد لزراعة الأنسجة مقاس 10 سم) ، وأعد الخلايا إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع رطوبة نسبية ≥95٪ و 5٪ ثاني أكسيد الكربون_لمدة 4 دقائق.
   2. بعد 4 دقائق ، قم بإخماد التربسين-EDTA باستخدام 2 أضعاف مستوى الصوت باستخدام وسائط mESC. انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي بحجم مناسب وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. بعد 5 دقائق ، قم بإزالة الأنبوب وشفط الوسائط دون إزعاج الحبيبات. أعد تعليق الحبيبات في وسائط KSR: N2 سعة 1 مل (1: 1) تحتوي على مثبط BMP LDN-193189 (250 نانومتر) ومثبط Wnt XAV-939 (10 ميكرومتر).
   3. قم بقياس تركيز الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الآلي. ابدأ في زراعة الخلايا كأجسام جنينية (EBs) عن طريق إضافة 75,000 خلية / مل في وسائط KSR: N2 (1: 1) تحتوي على LDN-193189 (250 نانومتر) و XAV-939 (10 ميكرومتر) في أطباق زراعة الأنسجة غير الملتصقة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع رطوبة نسبية ≥ 95٪ و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
2. في DD1 ، استعد ل "هبوط" الخلية عن طريق طلاء الأطباق المعالجة بزراعة الأنسجة ب poly-L-lysine (10 ميكروغرام / مل في PBS مع Ca^{2 +} / Mg²⁺) بين عشية وضحاها (O / N) عند 37 درجة مئوية مع رطوبة نسبية ≥ 95٪ أو لمدة ساعة واحدة على الأقل.
3. في DD2 ، قم بشفط poly-L-lysine وقم بتغطية الألواح بمادة اللامينين (10 ميكروغرام / مل في PBS مع Ca^{2 +} / Mg²⁺) O / N عند 37 درجة مئوية مع رطوبة نسبية ≥ 95٪.
   ملاحظه: في حين أن O / N هو الأمثل ، قد يكون أقل من 2 ساعة كافيا. إذا لم يتم استخدام الألواح بحلول اليوم التالي ، فقم بشفط اللامينين ، واستبدلها ب PBS بدون Ca^{2 + /} Mg²⁺ ، وخزنها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
4. DD3 ("الخلايا الأرضية")
   1. قبل البدء في تفكك EB ، قم بشفط اللامينين واترك الألواح تجف تماما في غطاء مزرعة الأنسجة. لا تستخدم الأطباق التي تبدو لامعة أو مبللة بشكل واضح. انقل EBs مع الوسائط إلى أنبوب سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 3-4 دقائق عند 15 × جم أو حتى يتم تكوير EBs.
5. قم بشفط الوسائط وإضافة 3 مل من محلول انفصال الخلايا الذي يحتوي على DNase (2 وحدة / مل) واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع رطوبة نسبية ≥ 95٪ و 5٪ ثاني أكسيد الكربون_لمدة 15 دقيقة.
6. بمجرد أن تصبح EBs غير مرئية أو انقضاء 15 دقيقة ، أضف 6 مل KSR: N2 (1: 1) تحتوي على DNase (1 U / mL) وجهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم.
7. قم بلوحة الخلايا في KSR: N2 (1: 1) التي تحتوي على LDN-193189 (250 نانومتر) ، XAV-939 (10 ميكرومتر) ، ومثبط ROCK Y-27632 (10 ميكرومتر) عند 4.5-5 × 10⁴ خلايا / سم².

المواد