مقالة منهجية

توليد الأسلاف العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر بطريقة القطرة المعلقة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Hanafiyah، A.، et al. تمايز وتوصيف الأسلاف العصبية والخلايا العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح الفيديو تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (mESCs) إلى الأجسام الجنينية (EBs) بطريقة القطرة المعلقة. عند تعليق mESCs في قطرات معلقة واحتضانها ، تتجمع الخلايا لتشكيل EBs ، والتي يتم تمييزها بشكل أكبر إلى خلايا سلفية عصبية (NPCs) باستخدام وسيط تمايز مكمل بحمض الريتينويك (RA).

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ثقافة mESC

  1. قم بتغطية صفيحة معالجة بزراعة الأنسجة مقاس 10 سم بجيلاتين 0.1٪ واترك الجيلاتين يتماسك لمدة 15-30 دقيقة على الأقل قبل شفطه.
  2. الخلايا الليفية الجنينية للفأر المشععة γ بالبذور (MEFs) قبل يوم واحد من زراعة الخلايا الليفية الجنينية للفأر في وسط mESC الدافئ مسبقا (وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع مصل بقري الجنين بنسبة 15٪ (FBS) ، والأحماض الأمينية غير الأساسية ، β-mercaptoethanol ، و L-glutamine ، والبنسلين / الستربتومايسين ، وبيروفات الصوديوم ، والعامل المثبط لسرطان الدم (LIF) ، و PD0325901 (PD) ، و CHIR99021 (CH)).
  3. اسمح ل MEFs المشععة γ بالاستقرار والالتصاق بسطح اللوحة قبل زراعة خلايا E14.
  4. قم بإذابة E14 ESCs في حمام مائي 37 درجة مئوية وانقل الخلايا بسرعة في أنبوب مخروطي 15 سم مع وسط mESC دافئ. حبيبات الخلايا في 200 × جم لمدة 3 دقائق وإزالة المادة الطافية.
  5. أعد تعليق الخلايا في 10 مل من وسط mESC وقم بوضع الخلايا الموجودة على لوحة الثقافة التي تحتوي على MEFs المشعة γ التي تم زرعها سابقا. احتضان زراعة الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  6. لمرور الثقافة ، قم بشفط الوسط وغسل اللوحة بمحلول ملحي معقم 1x مخزن بالفوسفات (PBS). أضف ما يكفي من 0.05٪ تريبسين لتغطية سطح اللوحة واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
  7. قم بتحييد التربسين باستخدام وسيط mESC والماصة لتوليد تعليق أحادي الخلية. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة 3 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية.
  8. عد الخلايا بمقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا وبذر حوالي 5.0 × 105 خلايا في صفيحة ثقافة 10 سم.
  9. أعد تعليق الخلايا في 10 مل من وسط mESC ، وقم بوضع الخلايا على لوحة زراعة الأنسجة المطلية بالجيلاتين واحتضان الثقافات كما هو موضح سابقا.
    ملاحظه: يوصى بمرور mESCs كل يومين لمنع الخلايا من التمايز في مستعمراتها. يعمل الفينول الأحمر في الوسط فقط كمؤشر للأس الهيدروجيني واعتمادا على الكثافة الخلوية ، يمكن أن يتحول إلى اللون الأصفر (أكثر حمضية) ، في وقت أقرب من يومين. وبالتالي ، قد يكون من الضروري تغيير الوسيط كل يوم. سوف تموت MEFs المعرضة للإشعاع γ في النهاية بعد مباراتين.
< p class = "jove_title" >2. EB و NPC وتمايز الخلايا العصبية

  1. قم بإجراء بروتوكول مرور الثقافة وعد الخلايا.
  2. طريقة التعليق (اليوم 0)
    1. بالنسبة للوحة زراعة الخلايا مقاس 10 سم ، عد ما يقرب من 2.5 × 104 خلايا حيث سيتم تعليق 5.0 × 102 خلية في وسط تمايز 20 ميكرولتر (DMEM مع 15٪ FBS ، والأحماض الأمينية غير الأساسية ، و β-mercaptoethanol ، و L-glutamine ، و penicillin / streptomycin ، وبيروفات الصوديوم). يمكن طلاء ما يقرب من خمسين قطرة سعة 20 ميكرولتر تحتوي على الخلايا على صفيحة واحدة مقاس 10 سم.
    2. اقتبس العدد المناسب من الخلايا ، ثم قم بالطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة 3 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية.
    3. أعد تعليق الخلايا في الحجم المناسب من وسط التمايز لكثافة خلية 5.0 × 10خليتان لكل 20 ميكرولتر (على سبيل المثال ، 2.5 × 104 خلايا في 1 مل من وسط التمايز).
    4. باستخدام ماصة دقيقة أو ماصة مكررة، ضع 20 ميكرولتر قطرات من معلق الخلية على غطاء لوحة زراعة الأنسجة. تأكد من أن القطرات ليست قريبة جدا من بعضها البعض لمنعها من الاندماج.
      ملاحظه: يمكن طلاء القطرات إما على لوحة تثبيت معالجة بزراعة الأنسجة أو لوحة تعليق حيث سيتم وضعها على الغطاء وليس على اللوحة نفسها. للحصول على نهج أكثر جدوى ومعقمة ، ضع القطرات على لوحة ثقافة الأنسجة المرفقة وانقلها إلى لوحة تعليق كما هو موضح أدناه.
    5. املأ الطبق ب 5-10 مل من 1x PBS وأعد الغطاء بعناية إلى اللوحة. احتضان الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية.
      ملاحظه: يضاف PBS إلى لوحة الثقافة لمنع الجفاف من القطرات.
  3. في اليوم 2 ، استخدم ماصة دقيقة لجمع القطرات من الغطاء ووضعها في صفيحة تعليق لزراعة الخلايا مقاس 10 سم مملوءة ب 10 مل من وسط التمايز. احتضان الثقافة على شاكر مداري يهتز بسرعة منخفضة في الحاضنة.
  4. في اليوم 4 ، لحصاد EBs ، اجمع الخلايا ، وجهاز الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 3 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية.
    ملاحظه: يمكن أيضا غسل EBs باستخدام 1x PBS وفقا لمتطلبات التجارب اللاحقة.
  5. لمواصلة الإجراء والحث على تمايز EB إلى خلايا سلفية عصبية (NPCs) ، قم بإعداد وسط التمايز بحمض الريتينويك 5 ميكرومتر (RA).
  6. قم بإزالة الوسط القديم عن طريق تكوير EBs عند 100 × جم لمدة 3 دقائق أو اترك EBs يستقر قبل شفط الوسط القديم. أضف 10 مل من وسط التمايز الذي يحتوي على 5 ميكرومتر RA إلى لوحة الاستزراع.
  7. في اليوم 6، استبدل نصف الوسط على الأقل بوسط جديد يحتوي على 5 ميكرومتر RA عن طريق إمالة اللوحة وسحب الوسط كما هو موضح أعلاه.
    ملاحظه: يوصى باستبدال نصف الوسط على الأقل بوسط جديد يحتوي على RA في اليومين 5 و 7. لاحظ مؤشر الفينول الأحمر. إذا تحول إلى اللون الأصفر ، فمن الأفضل استبدال كل الوسط.
  8. في اليوم 8 ، قم بحصاد الشخصيات غير القابلة للعب عن طريق جمع الخلايا ، والطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 3 دقائق ، وإزالة المادة الطافية.
    ملاحظه: يمكن أيضا غسل الشخصيات غير القابلة للعب باستخدام 1x PBS وفقا لاحتياجات التجارب اللاحقة. إذا لزم الأمر ، يمكن تجميد الشخصيات غير القابلة للعب وإذابتها مرة أخرى للثقافة والتحليل لاحقا. إذا كان سيتم استزراع الشخصيات غير القابلة للعب ، فيمكن أيضا استخدام أكوتا كبديل للتربسين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.05٪ تريبسين + 0.53 ملي EDTA 1X كورنينج 25-052-السيرة الذاتية 0.1٪ جيلاتين سيغما G1890-100G محضرة في ماء منزوع الأيونات CHIR99021 كيماويات كايمان 13122 [1] DMEM كورنينج 10-017 سم DMEM / F12 متوسط ثيرمو فيشر العلمي 11320033 المخزن المؤقت EB كياجين 19086 ايثانول 111000200 فارمكو مخفف في ماء منزوع الأيونات مصل الأبقار الجنينية أتلانتا بيولوجيكس S10250 ل-جلوتامين ثيرمو فيشر العلمي 25030024 ليف غير متاح غير متاح تم جمعها من الطاف MEF MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية كورنينج 25-025-Cl PD0325901 كيماويات كايمان 13034 [1] البنسلين / الستربتومايسين كورنينج 30-002-كلتر محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) غير متاح غير متاح محضرة في ماء منزوع الأيونات كلوريد البوتاسيوم P217-500G VWR فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة اللامائي 0781-500 جرام VWR كلوريد الصوديوم ص358-10 كواشف فيشر الحيوية فوسفات الصوديوم ، ثنائي القاعدة ، سباعي الهيدرات SX0715-1 ميليبور حمض الريتينويك سيغما R2625 محضر في DMSO بيروفات الصوديوم كورنينج 25-000-سنتيلتر β ميركابتو إيثانول فيشر الكواشف الحيوية بي ت 176-100

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة