إسكات الجينات بوساطة siRNA في الخلايا الجذعية العصبية

الملخص

المصدر: Nguyen, B.H., et al. زراعة ومعالجة خلايا القمة العصبية O9-1. J. Vis. Exp (2018)

يوضح هذا الفيديو استخدام الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNA) لإسكات جينات معينة ذات أهمية في الخلايا الجذعية العصبية وتمايزها إلى أنواع الخلايا المرغوبة باستخدام وسيط التمايز المناسب. يتيح هذا الإجراء دراسة الدور الحاسم لجينات معينة في عملية تمايز الخلايا الجذعية العصبية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. التلاعب بخلايا O9-1

1. أداء ضربة قاضية siRNA في خلايا O9-1
   1. قم بإذابة الثلج وتغطية صفيحة مكونة من 24 بئرا بمصفوفة غشاء القاعدية قبل بدء التجربة. استعادة خلايا O9-1 وبذرها ، مما يسمح لها بالنمو إلى 60٪ إلى 80٪ التقاء.
   2. خفف الجسيمات الشحمية في وسائط خالية من المصل وفقا لحجم البئر المناسب. خفف siRNA في وسائط خالية من المصل حتى النهائي. أضف siRNA المخفف إلى الجسيمات الشحمية المخففة بنسبة موصى بها من قبل الشركة المصنعة. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات ثم تحتضن.
      ملاحظه: اتبع دليل الشركة المصنعة حول الحجم المستخدم والوقت ودرجة حرارة الحضانة.
   3. أضف حجما مناسبا من مركب siRNA-lipid إلى الخلايا وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
   4. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا القياسية (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}). قم بتنفيذ خطوات المصب حسب الاقتضاء (استخراج الحمض النووي الريبي ، واستخراج البروتينات ، والتلوين ، وما إلى ذلك)< / > ملاحظة: يمكن أن تختلف أوقات ضربة قاضية siRNA وتركيزاتها اعتمادا على التجربة الفردية.

فئة

2. تمايز الخلايا O9-1

1. تمايز خلايا O9-1 إلى بانيات العظم
   1. لتحضير وسائط التمايز العظمي ، قم بتخفيف ما يلي في alpha-MEM (يشار إلى التركيزات النهائية): 0.1 ميكرومتر ديكساميثازون ، 100 نانوغرام / مل بروتين مورفوجيني للعظم 2 (BMP2) ، 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك ، 10 ملي مولار ب جليسيروفوسفات ، 10٪ FBS ، 100 وحدة / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين.
   2. اكتشف علامة بانيات العظم ، أوستيوكالسين ، في بانيات العظم المتمايزة عن طريق التلوين المناعي ، كما هو موضح في الشكل 1.
      ملاحظة: يمكن أيضا تقييم التمايز العظمي باستخدام علامات أخرى بانيات العظم أو مع تلطيخ أليزارين الأحمر أو تلطيخ الفوسفاتيز القلوي.
2. تمايز خلايا O9-1 إلى خلايا عضلية ملساء
   1. لتحضير وسائط تمايز خلايا العضلات الملساء ، قم بتخفيف ما يلي في DMEM (يشار إلى التركيزات النهائية): 100 وحدة / مل بنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، و 10٪ FBS.
   2. يقيم تمايز خلايا العضلات الملساء مع تلطيخ التألق المناعي باستخدام الأجسام المضادة ضد علامات خلايا العضلات الملساء ، مثل أكتين العضلات الملساء (SMA) ، كما هو موضح كمثال في الشكل 2.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تلطيخ التألق المناعي لعلامة بانيات العظم أوستيوكالسين (Ocn) مما يشير إلى أن خلايا O9-1 أدت إلى ظهور خلايا بانيات العظم في ظل ظروف التمايز العظمي. تم تلطيخ الخلايا بجسم مضاد Ocn لعلامة بانيات العظم (أخضر) ، وتم تلطيخ النوى ب DAPI (أزرق). تشير الأسهم إلى الخلايا الإيجابية ل OCN. أوستيوكالسين (Ocn ، علامة بانيات العظم) ؛ DAPI (′ ، 6-diamidino-2-phenylindole).

<...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات O9-1 الفأر خط خلية القمة العصبية القحفية ميليبور سيجما SCC049 DMEM، نسبة عالية من الجلوكوز، بدون جلوتامين جيبكو 11960-044 DMEM، ارتفاع نسبة الجلوكوز هيكلون SH30243.01 FBS (مصل الأبقار الجنينية) ميليبور سيجما ES-009-ب البنسلين - الستربتومايسين جيبكو 15140-122 L-glutamine 200mM (100X) جيبكو هاتف: 25030-081 Trypsin-EDTA 0.25٪ في HBSS جينيسي العلمية 25-510 DPBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco) بدون كالسيوم أو مغنيسيوم لونزا 17-512 فهرنهايت الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (MEM NEAA) 100X جيبكو 11140-050 بيروفات الصوديوم (100 ملم) جيبكو هاتف: 11360-070 2-ميركابتو إيثانول سيغما م -7522 عامل نمو الخلايا الليفية البشرية المؤتلف - أساسي (rhFGF-basic) أنظمة البحث والتطوير 233-FB-025 ميتومايسين سي روش 10107409001 مصفوفة Matrigel كورنينج 356234 DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد) ميليبور سيجما MX1458-6 ليبوفيكتامين RNAiMAX ثيرمو فيشر العلمي 13778-075 Opti-MEM I (1X) جيبكو 31985-070 الحد الأدنى من الوسط الأساسي ، alpha 1X مع أملاح إيرل ، والريبونوكليوسيدات ، وديوكسي ريبونوكليوسيدات ، و L-الجلوتامين كورنينج 10-022-السيرة الذاتية ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA دارماكون L-041057 مجمع ON-TARGETplus غير المستهدف دارماكون د-001810 ON-TARGETplus Yap1 siRNA دارماكون L-046247 FCS (مصل ربلة الساق الجنينية) ITS (الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم) TGF-b3 حمض الأسكوربيك BMP2 (بروتين مورفوجيني للعظام 2) ديكساميثازون مكمل B-27