عزل مستعمرات الخلايا السلفية العصبية المستحثة المشتقة من الخلايا الليفية البشرية البالغة

الملخص

المصدر: Meyer، S. et al. ، اشتقاق الخلايا الليفية البشرية البالغة وتحويلها المباشر إلى خلايا سلفية عصبية قابلة للتوسيع.J. Vis. إكسب. (2015).

يوضح هذا الفيديو تقنية لعزل الخلايا السلفية العصبية المستحثة (iNPCs) المشتقة من الخلايا الليفية البشرية البالغة. يحدد الخطوات المتبعة في عزل مستعمرات iNPC وزراعتها في آبار صفائح متعددة الآبار مطلية بطبقة لامينين في وجود وسائط استزراع مناسبة تسهل استمرار الانتشار والتوسع في عدد سكان iNPC.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. عزل مستعمرات الخلايا السلفية العصبية المستحثة المفترضة (iNPC)

1. قبل يوم واحد من قطف مستعمرات iNPC ، قم بتغطية 48 صفيحة بئر بطبقة باللاتينية: قم بتخفيف اللامينين إلى 1 ميكروغرام / مل في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco ، أضف 300 ميكرولتر من المحلول على الأطباق ، واحتفظ به عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة. بعد يوم واحد ، قم بشفط اللامينين من الألواح وأضف 200 ميكرولتر من وسائط الحث العصبي (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal ، 1x N2 ، 1x B27 ، 1٪ GlutaMAX ، 10 نانوغرام / مل عامل مثبط لسرطان الدم البشري ، 3 ميكرومتر CHIR99021 ، 2 ميكرومتر SB431542) إلى الآبار.
2. اغسل 6 ألواح بئر تحتوي على المستعمرات المراد قطفها مرة واحدة باستخدام DPBS وأضف 2 مل من وسائط الحث العصبي لكل بئر من 6 ألواح بئر. اختر المستعمرات ميكانيكيا: اكشط حول المستعمرات باستخدام إبرة رفيعة للتخلص من الخلايا المحيطة ؛ اضبط أداة الماصة سعة 200 ميكرولتر على 50 ميكرولتر واختر المستعمرات باستخدام أطراف الماصة المعنية.
3. انقل مستعمرة واحدة إلى بئر واحد من 48 صفيحة بئر مطلية باللون اللامينين وقم بإنشاء تعليق خلية واحدة ميكانيكيا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 مرات. أضف مثبط ROCK Y27632 بتركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومتر إلى الخلايا.
4. قم بزراعة الخلايا على صفيحة البئر 48 عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة يومين. قم بتغيير الوسائط كل يومين حتى تصل الخلايا إلى 80-90٪ من التقاء (حوالي 3-4 أيام).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات CHIR99021 أكسون ميدكيم 1386 DMEM F12 لايف تكنولوجيز هاتف: 11320-033 DPBS لايف تكنولوجيز 14190-094 جلوتاماكس لايف تكنولوجيز 35050-038 hLIF بيبروتك 300-05 لامينين سيغما L2020 N2 لايف تكنولوجيز 17502-048 العصبي العصبي لايف تكنولوجيز هاتف: 21103-049 SB431542 إنفيفوجين INH-SB43 Y27632 كالبيوكيم سجل المستخلصات الكيميائية 146986-50-7 ب 27 لايف تكنولوجيز 17504-044