توليد ثقافة عصبية منخفضة الكثافة للغاية باستخدام طبقة تغذية عصبية عالية الكثافة

الملخص

المصدر: Lu ، Z. et al. ، طريقة مبسطة لثقافة الخلايا العصبية الأولية في الحصين منخفضة الكثافة وطويلة الأمد.J. Vis. Exp.(2016).

يوضح هذا الفيديو طريقة زراعة الخلايا العصبية منخفضة الكثافة للغاية في وجود طبقة تغذية عصبية عالية الكثافة. يؤسس ثقافة مشتركة للخلايا العصبية ذات الكثافة المختلفة ، مما يضمن القرب الجسدي الوثيق. تساعد عوامل النمو التي تفرزها الخلايا العصبية عالية الكثافة على بقاء الخلايا العصبية ونموها ، مما يحافظ على الخلايا العصبية منخفضة الكثافة لفترة زمنية أطول.

البروتوكول

فئة

1. تحضير لوحات 24 بئر لثقافات الخلايا العصبية عالية الكثافة

ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات التالية (2-3) في اليوم السابق للحصاد المخطط للأجنة.

1. أحضر لوحين بسعة 24 بئرا في غطاء مزرعة الخلية وافتح العبوة الفردية.
2. قم بتوصيل إبرة حقنة 18 جم بحقنة بلاستيكية تستخدم مرة واحدة سعة 1 مل.
3. أمسك المحقنة ووجه طرف الإبرة عند ~ 1 مم إلى اليسار إلى وسط قاع البئر. استخدم قوة معتدلة (~ 250 جم) لحفر قاع البئر (~ 1 مم). سيتم تشكيل أخدود ، وستشكل المواد البلاستيكية التي تم إزاحتها دعما مرتفعا فوق سطح البئر السفلي المسطح. قم بحفر أخدود متوازي آخر بطول ~ 1 مم عند ~ 1 مم على يمين مركز القاع بطريقة مماثلة.
4. كرر هذه الخطوة لجميع آبار اللوحين المكونين من 24 بئرا. اللوحتان المكونتان من 24 بئرا المستخدمة في الاستزراع عالي الكثافة جاهزة الآن للطلاء ب poly-D-lysine (انظر الخطوة 2.8 أدناه).

فئة

2. تحضير الأغطية لثقافات الخلايا العصبية منخفضة الكثافة

1. استخدم زجاجا دائريا بقطر 12 مم # 1.
2. ضع 50 غطاء داخل طبق بتري بلاستيكي معقم بقطر 100 مم وغمر أغطية في محلول إيثانول 20 مل 70٪. ضع طبق بتري هذا على منصة دوارة مع دوران معتدل السرعة (70 دورة في الدقيقة) لمدة ساعة. قم بإزالة 70٪ من الإيثانول ثم استبدلها بدفعة جديدة من 70٪ من الإيثانول. قم بالتدوير واغسله لمدة ساعة أخرى.
3. تخلص من محلول تنظيف الإيثانول بنسبة 70٪. أضف الماء المعقم (مفلتر من خلال وحدة الترشيح 0.2 ميكرومتر). اشطف الغطاء بإصرامة عن طريق تدوير طبق بتري يدويا. اشطفها ثلاث مرات ، واستبدلها بالماء المعقم العذب في كل مرة.
4. ضع طبق بتري مع أغطية داخل غطاء مزرعة خلايا معقم مع تدفق رقائقي. قم بشفط ماء الشطف من خلال خط التفريغ وأضف 10 مل من الماء المعقم المصفى لغمر الأغطية. يجب أن تكون الأغطية معقمة ، ويجب أن يكون السطح نظيفا بدرجة كافية لطلاء بولي دي ليسين.
5. افتح طبقين بسعة 24 بئرا من عبوتهما الفردية وضعهما في الغطاء.
6. قم بتشغيل خط التفريغ في الغطاء. قم بتوصيل طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر بخط التفريغ واستخدم مقصا لقطع الطرف لإنشاء فتحة أكبر.
7. استخدم ملاقط ذات طرف رفيع # 5 لالتقاط أغطية من طبق بتري ، واحدة تلو الأخرى ، واستخدم خط التفريغ لتجفيف الغطاء تماما. ثم ضع غطاء واحد في كل من آبار اللوحة المكونة من 24 بئرا. يجب أن تكون الغطاءات ال 50 التي تم تنظيفها كافية لملء كل من آبار اللوحين المكونين من 24 بئرا.
8. قم بتخفيف محلول مخزون بولي د-ليسين (1 مجم / مل) في محلول عملي (0.1 مجم / مل) مع مخزن مؤقت للبورات (درجة الحموضة 8.5). بالنسبة للألواح الأربعة المكونة من 24 بئرا (بما في ذلك لوحين عالي الكثافة مع قاع محفور) ، قم بإعداد 30 مل من محلول العمل الكلي.
9. أضف 300 ميكرولتر 0.1 مجم / مل محلول عمل بولي دي ليسين إلى كل بئر بأغطية زجاجية. تأكد من أن الأغطية مغمورة تماما في المحلول. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاستخدم طرف الملقط # 5 للضغط على الغطاء لأسفل على قاع البئر ، واستخدم الطرف لتوجيه محلول بولي دي ليسين لتغطية كل سطح الغطاء. افحص بصريا جميع أغطية الغطاء للتأكد من عدم احتجاز الهواء بين اللوحة والغطاء.
10. أضف 300 ميكرولتر 0.1 مجم / مل من محلول عمل بولي دي ليسين إلى كل بئر من لوحة الاستزراع عالية الكثافة ذات القاع المحفور. قم بالتدوير باليد لنشر المحلول لتغطية قاع البئر بالكامل.
11. أعد جميع الألواح الأربعة التي تحتوي على poly-D-lysine إلى حاضنة الثقافة ، واحتضان O / N.

< p class = "jove_title" >3. غسل وتكييف أطباق للثقافة

< p class = "jove_content" >ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية (3-5) في يوم حصاد الأنسجة.

1. بعد حضانة / طلاء الغطية وألواح 24 بئرا O / N ، أحضر جميع الألواح الأربعة (اثنتان مع أغطية مانحة ، واثنين من الألواح عالية الكثافة مع قاع بلاستيكي محفور) في غطاء المزرعة. استخدم خط التفريغ لإزالة محلول بولي دي ليسين.
2. مباشرة بعد إزالة محلول بولي دي ليسين ، أضف ~ 1 مل من الماء المعقم إلى كل بئر باستخدام ماصة نقل البلاستيك. بعد أن تمتلئ جميع الآبار بالماء ، اتركه لمدة 10 دقائق. قم بإزالة الماء بالمكنسة الكهربائية ، ثم أضف 300 ميكرولتر اغسل وسط في كل بئر لتغطية قاع البئر (مع أو بدون أغطية زجاجية). لا تدع طلاء بولي دي ليسين يجف.
3. أعد جميع اللوحات الأربعة إلى حاضنة الخلية. تكون اللوحات جاهزة للاستخدام بمجرد تحضير الخلايا العصبية في الحصين المشتتة.

< ص class = "jove_title" >4. طلاء الخلايا العصبية والثقافة المشتركة طويلة الأمد

1. أحضر الصفيحتين المكونتين من 24 بئرا مع قيعان محفورة للخلايا العصبية عالية الكثافة في غطاء زراعة الخلايا. قم بإزالة وسط التكييف المسبق 300 ميكرولتر بالمكنسة الكهربائية. لوحة 0.6 مل معلقات خلية عالية الكثافة عند 250,000 خلية عصبية / مل.
2. أحضر اللوحين الأخريين المكونين من 24 بئرا مع أغطية في غطاء الغطاء وقم بإزالة وسط التكييف المسبق سعة 300 ميكرولتر بالمكنسة الكهربائية. لوحة 0.6 مل معلقات خلية منخفضة الكثافة عند 10,000 خلية عصبية / مل على الغطاء داخل لوحين 24 بئرا.
3. أعد جميع الأطباق الأربعة المكونة من 24 بئرا إلى الحاضنة. دعه يجلس لمدة 2 ساعة.
4. اقلب الأغطية منخفضة الكثافة مع الخلايا العصبية الملتصقة بالثقافة عالية الكثافة. تأكد من أن الخلايا العصبية تواجه بعضها البعض (أي غير مفصولة بالغطاء الزجاجي). ثم أعد اللوحين مع الثقافة المشتركة إلى الحاضنة.

< p class = "jove_title" >5. استدامة الثقافة المشتركة

1. قم بتغذية المزارع المشتركة عن طريق إضافة 300 ميكرولتر من وسط الأعلاف الطازجة (انظر المواد) في اليوم في المختبر (DIV) 5. ليست هناك حاجة لإزالة 50٪ من وسط الثقافة الكامل الأصلي ، كما ذكرت العديد من الدراسات الأخرى. يحتوي وسط التغذية أيضا على 15 ميكرومتر من السيتوزين أرابينوسيد (Ara-C ، لإنتاج تركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر) لتقليل فرصة تلوث الخلايا الدبقية وانتشارها.
2. بعد هذه التغذية الأولية ، أضف 300 ميكرولتر من وسط العلف الطازج بدون Ara-C إلى البئر كل أسبوع. إذا تم الاحتفاظ بالمزرعة لأكثر من شهر واحد ، فاستبدل نصف الوسط بوسط علف طازج كل أسبوع بعد نقطة زمنية واحدة بعد شهر واحد (مع أول نصف استبدال متوسط عند DIV33). من الناحية الشكلية ، تبدو كل من الخلايا العصبية عالية الكثافة ومنخفضة الكثافة صحية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر (أطول وقت لاحظه المجربون).

المواد