تمايز خط خلايا الورم الأرومي العصبي البشري إلى خلايا عصبية ناضجة

الملخص

المصدر: Shipley ، M. M. ، et al. تمايز خط خلايا الورم الأرومي العصبي البشري SH-SY5Y. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو تقنية لتحويل خلايا الورم الأرومي العصبي SH-SY5Y غير المتمايزة إلى خلايا عصبية ناضجة متمايزة تماما باستخدام تقنية مرور منهجية. يتضمن ذلك زراعة الخلايا في سلسلة من الوسائط مع انخفاض تدريجي في مستويات المصل لمنع تكاثر الخلايا الشبيهة بالظهارة مع تعزيز تمايز وتكاثر الخلايا الشبيهة بالخلايا العصبية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استكمال الوسائط بحمض الريتينويك وعوامل النمو المحددة التي تحفز التمايز النهائي للخلايا الشبيهة بالخلايا العصبية إلى خلايا عصبية ناضجة تظهر مورفولوجيا متفرعة واسعة النطاق.

البروتوكول

1. اعتبارات عامة

1. انظر جدول المواد / المعدات للحصول على قائمة بالكواشف الضرورية. قم بتنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف معقمة صارمة.
2. استخدم مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة (hiFBS) لجميع مستحضرات الوسائط التي تشمل FBS. لتعطيل الحرارة ، قم بتسخين كمية 50 مل من FBS عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، مع قلبها كل 10 دقائق (انظر أيضا الجدول 1).
   ملاحظه: عند استخدام FBS بدون تعطيل حراري ، يتطور النمط الظاهري الشبيه بالظهارة بسرعة أكبر في جميع أنحاء مزارع خلايا SH-SY5Y.
3. قبل الاستخدام ، اسمح للوسائط بالتسخين والتوازن في حاضنة لإنشاء توازن مناسب للأس الهيدروجيني قبل كل خطوة. على سبيل المثال ، يستغرق 50 مل من الوسائط حوالي ساعة واحدة لتحقيق التوازن الكامل (درجة الحموضة 7 ، 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}).
   ملاحظه: يستخدم هذا البروتوكول إجراء تقسيم من خطوتين يتطلب خلايا SH-SY5Y متمايزة جزئيا ليتم تربسين وإعادة طلاءها. هذه عملية مرهقة لهذه الخلايا الهشة بشكل استثنائي. لذلك ، من المهم احتضان الخلايا في التربسين لأقل قدر من الوقت. سيسمح ذلك بالرفع التفضيلي للخلايا العصبية ، مما يترك الخلايا الشبيهة بالظهارة لا تزال متصلة بالطبق.
4. قم بإجراء تجربة الخلايا المتمايزة ببطء باستخدام ماصة بلاستيكية سعة 10 مل مع الطرف مقابل الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على الخلايا. قم بإجراء التجربة بسرعة بطيئة ، لأعلى ولأسفل لا تزيد عن خمس مرات.
   

فئة

2. ذوبان الجليد وزراعة خلايا الورم الأرومي العصبي SH-SY5Y غير المتمايزة

1. إعداد وسائط النمو الأساسية.
2. قم بإذابة الخلايا المجمدة بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية (حوالي 2 دقيقة).
3. أعد تعليق الخلايا في 9 مل من وسائط النمو الأساسية في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، ثم جهاز الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 1,000 × جم.
4. شفط المادة الطافية مع الحرص على عدم إزعاج الخلايا المحببة ، وأعد تعليق الخلايا برفق في 10 مل من وسائط النمو الأساسية.
5. ضع خلايا اللوحة على قارورة T-25 أو طبق 60 مم².
6. في اليوم التالي ، استبدل الوسائط لإزالة الخلايا الميتة.

< p class = "jove_title" >3. اليوم 0: خلايا الطلاء للتمايز

1. انظر الشكل 1 للاطلاع على جدول التمايز.
2. اشطف الخلايا غير المتمايزة باستخدام 1x PBS ، واستنشق ، ثم قم بالتربسين باستخدام 1-2 مل دافئ 1x 0.05٪ Trypsin-EDTA.
3. عندما تكون الخلايا في التربسين ، احتضنها لمدة 3 دقائق تقريبا في حاضنة.
4. اروي التربسين بإضافة 10 مل من وسائط النمو الأساسية ، واشطف جوانب القارورة أو الطبق ، ثم قم بترتيتر برفق 1-3 مرات. انقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
5. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 1,000 × جم واستنشق الوسائط مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات.
6. أعد تعليق الحبيبات في 5 مل من وسائط النمو الأساسية وثلاثية 1-3 مرات.
7. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم ، ثم قم بتخفيفه باستخدام وسائط النمو الأساسية إلى 50,000 خلية / مل.
8. طبق 2 مل من الخلايا لكل طبق 35 مم² ليصبح المجموع 100,000 خلية لكل طبق ووضعها مرة أخرى في الحاضنة.

4. اليوم 1: تغيير الوسائط (وسائط التمايز # 1)

1. Aliquot 50 مل من وسائط التمايز # 1 (انظر الجدول 2) واحتضانها في حمام مائي 37 درجة مئوية.
2. عند تسخين الوسائط ، اتركها تتوازن في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) لمدة ساعة واحدة على الأقل لإنشاء توازن مناسب للأس الهيدروجيني قبل الاستخدام.
3. أضف حمض الريتينويك (RA) (انظر الجدول 1) إلى الوسائط الدافئة والمتوازنة مباشرة قبل إضافة الوسائط إلى الأطباق.
   ملاحظه: حمض الريتينويك حساس للضوء ويجب تخزينه في زجاجات داكنة عند 4 درجات مئوية
4. استنشق الوسائط القديمة برفق وتخلص منها.
5. أضف 2 مل من وسائط التمايز # 1 مع RA لكل طبق 35 مم² والعودة إلى الحاضنة.

5. اليوم 3: تغيير الوسائط (وسائط التمايز # 1)

1. كرر القسم 4 (الخطوات من 1 إلى 5)

6. اليوم 5: تغيير الوسائط (وسائط التمايز # 1)

1. كرر القسم 4 (الخطوات من 1 إلى 5)

7. اليوم 7: تقسيم الخلايا 1:1

1. أضف RA إلى وسائط التمايز الدافئة والمتوازنة # 1 مباشرة قبل إضافة الوسائط إلى الأطباق.
2. استنشق الوسائط القديمة برفق وتخلص منها.
3. أضف 200 ميكرولتر دافئ 0.05٪ 1x Trypsin EDTA لكل طبق 35 مم² ودفئه في حاضنة لمدة 2-3 دقائق تقريبا أو حتى يتم رفع الخلايا بشكل واضح من اللوحة كما لوحظ تحت المجهر.
4. قم بإخماد التربسين عن طريق إضافة 2 مل من وسائط التمايز # 1 مع RA لكل طبق 35 مم² واستخدم الوسائط لشطف الخلايا العصبية المتبقية من اللوحة. ثم انقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
   ملاحظه: لا تقم بتربسين الكثير من الأطباق في وقت واحد أثناء خطوات التربسين. يساعد هذا على ضمان عدم احتضان الثقافات العصبية في التربسين لفترة طويلة جدا ، والتي يمكن أن تكون سامة للخلايا.
5. امزج المحتويات من ما يصل إلى 10 أطباق في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل وقم بترتيبت ببطء لأعلى ولأسفل بما لا يزيد عن خمس مرات باستخدام ماصة بلاستيكية سعة 10 مل.
6. Aliquot 2 مل معلق الخلية في أطباق طازجة 35 مم² والعودة إلى الحاضنة.

8. اليوم 8: تغيير الوسائط (وسائط التمايز # 2)

1. أضف RA (انظر الجدول 1) إلى الوسائط الدافئة والمتوازنة مباشرة قبل إضافة الوسائط إلى الأطباق.
2. استنشق الوسائط القديمة برفق وتخلص منها.
3. أضف ببطء 2 مل من وسائط التمايز # 2 (انظر الجدول 2) مع RA لكل طبق 35 مم² والعودة إلى الحاضنة. لا تسمح للخلايا العصبية بالتعرض للهواء لفترة طويلة لأنها يمكن أن تجف بسرعة.

9. اليوم 9: تحضير أطباق مغلفة بالمصفوفة خارج الخلية (ECM)

1. قم بإذابة قارورة واحدة من محلول ECM على الجليد وقم بتخفيفه بنسبة 1: 100 في DMEM البارد.
2. ضعي 2 مل من الخليط في كل طبق مقاس 35 مم² وتأكد من تغطية قاعدة الطبق بالكامل.
3. ضعها في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) لمدة ساعة واحدة أو طوال الليل.
4. خلط الشفط واتركه يجف في الهواء لمدة 1 ساعة تقريبا في الغطاء. يحفظ في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 2 أشهر.

فئة

10. اليوم 10: نقل الخلايا إلى ألواح مطلية ب ECM 1: 1

1. أضف RA (انظر الجدول 1) إلى الوسائط الدافئة والمتوازنة مباشرة قبل إضافة الوسائط إلى الأطباق.
2. استنشق الوسائط برفق وتخلص منها.
3. أضف 200 ميكرولتر من التربسين الدافئ إلى كل طبق 35 مم² واتركه يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 دقيقة تقريبا أو حتى يتم رفع الخلايا العصبية بشكل واضح من الطبق كما لوحظ تحت المجهر.
   ملاحظه: قم بتنفيذ خطوة التربسين هذه في درجة حرارة الغرفة لتجنب الإفراط في احتضان الخلايا العصبية بالتربسين والتسبب في التلف. تطلق الخلايا العصبية من الصفائح بشكل أسرع بكثير من الخلايا الشبيهة بالظهارة في هذه المرحلة.
4. قم بإخماد التربسين عن طريق إضافة 2 مل من وسائط التمايز # 2 لكل طبق 35 مم² واستخدم الوسائط لشطف الخلايا العصبية المتبقية من اللوحة. ثم انقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
5. امزج المحتويات من ما يصل إلى 10 أطباق في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل وقم بترتيبت ببطء لأعلى ولأسفل بما لا يزيد عن خمس مرات باستخدام ماصة بلاستيكية سعة 10 مل.
6. قم بتوزيع معلق الخلية 2 مل في أطباق 35 مم² مطلية ب ECM وأعدها إلى الحاضنة.

11. اليوم 11: تغيير الوسائط (وسائط التمايز # 3)

1. أضف RA (انظر الجدول 1) إلى الوسائط الدافئة والمتوازنة مباشرة قبل إضافة الوسائط إلى الأطباق.
2. استنشق الوسائط القديمة برفق وتخلص منها.
3. أضف ببطء 2 مل من وسائط التمايز # 3 (انظر الجدول 2) مع RA لكل طبق 35 مم² والعودة إلى الحاضنة. لا تسمح للخلايا العصبية بالتعرض للهواء لفترة طويلة.

12. اليوم 14: تغيير الوسائط (وسائط التمايز # 3)

1. كرر القسم 11 (الخطوات 1-3)

13. اليوم 17: آخر تغيير في الوسائط (وسائط التمايز # 3)

1. كرر القسم 11 (الخطوات 1-3)

< ص الفئة = "jove_title" >14. اليوم 18: الثقافات العصبية جاهزة للاستخدام

1. قم بتغيير الوسائط إلى وسائط التمايز الجديدة # 3 مع RA كل 3 أيام للحفاظ على صحة الخلايا العصبية.
   ملاحظه: يجب تمييز الخلايا إلى خلايا عصبية وإظهار نمط ظاهري عصبي. عادة ما تكون الثقافات مستقرة لمدة تصل إلى 14 يوما بعد التمايز النهائي. ومع ذلك ، فإن مدة بقاء الخلايا العصبية تعتمد على رقم مرور الخلايا غير المتمايزة في بداية التمايز. تنتج أرقام المرور الأعلى خلايا عصبية متمايزة ذات عمر مفيد أقصر.

الجدول 1: حلول المخزون ومكوناته.

مكون التفاصيل رصيد تعليمات 10 ميكرومتر RA حمض الريتينويك المتحولة بالكامل 5 ملي متر أعد تعليق 50 مجم RA في 33.3 مل 95٪ EtOH. التهاب المفاصل الروماتويدي حساس للحرارة والضوء والهواء. يحفظ في زجاجة داكنة ويحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أسابيع. يستخدم عند تخفيف 1: 500 وقم بتخفيفه في وسائط التمايز مباشرة قبل الاستخدام (300.44 جم / مول) 1x B-27 مكمل B-27 50 ضعفا قم بإذابة زجاجة 1-10 مل والباقي في 1 مل للاستخدام مرة واحدة وتخزينها في -80 درجة مئوية. قم بتخزين زجاجات 10 مل عند -20 درجة مئوية 20 ملي مولار KCl كلوريد البوتاسيوم 1 م أضف 250 مل من الماء إلى 18.6 جم KCl وفلتر معقم. يحفظ في درجة حرارة الغرفة (74.55 جم / مول) 2 مللي متر ديسيبل-cAMP ثنائي بوتيريل AMP الدوري 1 م قم بتعليق الزجاجة الممتلئة بإضافة 2.04 مل من الماء إلى 1 جم ديسيبل cAMP. حساسة للضوء والرطوبة. يحفظ في كميات كبيرة من 100 ميكرولتر أو 200 ميكرولتر عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية (491.37 جم / مول) 50 نانوغرام / مل BDNF عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) - قارورة الطرد المركزي للحصول على مسحوق إلى القاع. أعد تعليق 10 ميكروغرام قارورة في 1 مل Neurobasal + 1x B27 أو 5 ميكروغرام قارورة في 0.5 مل Neurobasal + 1x B27 للحصول على 10 ميكروغرام / مل. استخدم عند التخفيف 1: 200. تخزين حصص العمل عند -80 درجة مئوية (على سبيل المثال: 250 ميكرولتر) hiFBS مصل الأبقار الجنينية المعطل بالحرارة - قام Aliquot بإذابة FBS في أنابيب مخروطية سعة 50 مل. يسخن على حرارة 56 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة وتجميد حصص العمل عند -20 درجة مئوية

الجدول 2: وصفات الوسائط.

وسائط النمو الأساسية مكون حجم 500 مل التخفيف إيم إيم 415 مل EMEM 15٪ hiFBS 75 مل hiFBS 1x القلم / البكتيريا 5 مل قلم / Strep 1:100 2 ملي جلوتامين 5 مل جلوتامين 1:100 * احتفظ لمدة 6 أسابيع كحد أقصى وسائط التمايز # 1 مكون حجم 50 مل التخفيف إيم إيم 48 مل EMEM 2.5٪ hiFBS 1.3 مل hiFBS 1x القلم / البكتيريا 500 ميكرولتر قلم / بكتيريا 1:100 2 ملي جلوتامين 500 ميكرولتر من الجلوتامين 1:100 10 ميكرومتر RA 100 ميكرولتر RA (مخزون 5 ملم) 1:500 * احتفظ لمدة أسبوعين كحد أقصى وأضف RA مباشرة قبل الاستخدام * لا تحتفظ بوسائط إضافية بمجرد إضافة RA - RA غير مستقر وسائط التفاضل # 2 مكون حجم 50 مل التخفيف إيم إيم 49 مل EMEM 1٪ hiFBS 500 ميكرولتر hiFBS 1x القلم / البكتيريا 500 ميكرولتر قلم / بكتيريا 1:100 2 ملي جلوتامين 500 ميكرولتر من الجلوتامين 1:100 10 ميكرومتر RA 100 ميكرولتر RA (مخزون 5 ملم) 1:500 * احتفظ لمدة أسبوعين كحد أقصى وأضف RA مباشرة قبل الاستخدام * لا تحتفظ بوسائط إضافية بمجرد إضافة RA - RA غير مستقر وسائط التمايز # 3 مكون حجم 50 مل التخفيف العصبي العصبي 47 مل نيوروبازال 1x B-27 1 مل B-27 (مخزون 50X) 1:50 20 ملي كلوريد القطر 1 مل KCl (1 مليون مخزون) 1:50 1x القلم / البكتيريا 500 ميكرولتر قلم / بكتيريا 1:100 2 ملي جلوتاماكسي 500 ميكرولتر GlutamaxI (مخزون 100x) 1:100 50 نانوغرام / مل BDNF 250 ميكرولتر من مخزون BDNF (10 ميكروغرام / مل) 1:200 2 ملي مولار ثنائي بوتيريل أمبير دوري (ديسيبل-cAMP) 100 ميكرولتر ديسيبل-cAMP (1 مليون مخزون) 1:500 10 ميكرومتر RA 100 ميكرولتر RA (مخزون 5 ملليمتر) 1:500 * احتفظ لمدة أسبوعين كحد أقصى وأضف RA مباشرة قبل الاستخدام * لا تحتفظ بوسائط إضافية بمجرد إضافة RA - RA غير مستقر

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: الجدول الزمني لإجراء التمايز. تتكون عملية التمايز من 11 خطوة موزعة على مدار فترة 18 يوما. في اليوم الأول من بروتوكول التمايز (اليوم 0) ، يتم طلاء ما بين 25,000 و 100,000 خلية على أطباق 35 مم غير مطلية. في الأيام 1 و3 و5، تتم إزالة الوسائط القديمة وتطبيق وسائط التمايز #1. في اليوم 7 ، يتم تقسيم الخلايا 1: 1 إلى أطباق غير مطلية مقاس 35 مم في وسائط التمايز # 1. في اليوم 8 ، يتم تغيير...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ب -27 ثيرموفيشر العلمي 17504-044 انظر الجدول 1 للتحضير عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) سيغما SRP3014 (10 ميكروغرام) / B3795 (5 ميكروغرام) انظر الجدول 1 للتحضير ثنائي بوتيريل AMP الدوري (db-cAMP) سيغما د0627 انظر الجدول 1 للتحضير DMSO ATCC 4-X - الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسي (EMEM) سيغما م 5650 - مصل الأبقار الجنينية (FBS) هيكلون SH30071.03 انظر الجدول 1 للتحضير جلوتاماكسي تقنيات الحياة 35050-061 - الجلوتامين هيكلون SH30034.01 - كلوريد البوتاسيوم (KCl) فيشر ساينتيك ص366-1 انظر الجدول 1 للتحضير حل MaxGel Extracell Matrix (ECM) سيغما E0282 انظر الخطوة 11 من البروتوكول العصبي العصبي تقنيات الحياة هاتف: 21103-049 - البنسلين / الستربتومايسين (القلم / البكتيريا) تقنيات الحياة 15140-122 - حمض الريتينويك (RA) سيغما R2625 يجب تخزينه في الظلام عند 4 درجات مئوية لأن هذا الكاشف حساس للضوء خلايا SH-SY5Y ATCC علامة الإدارة-2266 - 0.5٪ تريبسين + EDTA تقنيات الحياة 15400-054 - أطباق فالكون 35 مم TC فالكون (ماركة كورنينج) 353001 -