مقالة منهجية

تقنية لتوليد الخلايا السلفية العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Mao, X., et al. التمايز العصبي من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر في المختبر. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو طريقة لتوليد الخلايا السلفية العصبية في المختبر (NPCs) من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (mESCs). يتم استزراع mESCs في تعليق لتشكيل أجسام جنينية (EBs) ، والتي يتم توجيهها بعد ذلك للتمايز إلى NPCs عن طريق معالجة حمض الريتينويك في ثقافة ملتصقة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. زراعة الخلايا الجذعية الجنينية للفأر

  1. تحضير أطباق أو أطباق زراعة الخلايا المطلية بالجيلاتين بنسبة 0.1٪.
    1. أضف 2 مل من الجيلاتين المعقم 0.1٪ (0.1٪ وزن / حجم في الماء) إلى أطباق زراعة الخلايا 60 مم. صخور بلطف لضمان طلاء متساو لأطباق زراعة الخلايا.
    2. ضع الأطباق في حاضنة 5٪CO2 عند 37 درجة مئوية واتركها تطليها لمدة 1 ساعة.
    3. قم بإزالة محلول الجيلاتين 0.1٪ قبل بذر الخلايا.
      ملاحظه: بعد إزالة الجيلاتين ، ليست هناك حاجة لتجفيف أو غسل الأطباق المطلية.
  2. مزرعة الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (A2lox و 129)
    1. احتضان خلايا mESCs (A2lox و 129) في أطباق زراعة الخلايا المغلفة بالجيلاتين بنسبة 0.1٪ 60 مم في وسط نمو mESC عند 37 درجة مئوية في حاضنةCO2 بنسبة 5٪ ، على التوالي. يتكون وسط نمو mESC من 85٪ خليط متوسط / مغذي من Dulbecco معدل F-12 (DMEM / F12) ، 15٪ بدائل مصل بالضربة القاضية (KSR) ، 0.1 ملي مولار β-mercaptoethanol (2ME) ، 2 ملي مولار GlutaMAX ، 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (P / S) ، 1000 U / مل عامل مثبط لسرطان الدم (LIF) ، 10 نانومتر CHIR-99021 (مثبط GSK-3) و 0.33 نانومتر PD0325901 (مثبط MEK).
      تنبيه: β-mercaptoethanol قابل للاشتعال وله سمية استنشاق. الابتعاد عن مصادر الحريق وارتداء قناع لتجنب الاستنشاق عند الاستخدام.
    2. قم بتغيير وسط نمو mESC يوميا لتحسين نمو A2lox و 129.
    3. عندما تصل الخلايا إلى 80٪ من التقاء ، قم بإزالة الوسط وأضف 1 مل من 0.1٪ تريبسين إلى الطبق. هزة بلطف لمدة 30 ثانية لضمان تغطية متساوية من التربسين على جميع الخلايا.
    4. اترك الخلايا لمدة دقيقة واحدة تقريبا حتى تتربسين ثم قم بإزالة التربسين باستخدام ماصة سعة 1 مل.
    5. أضف 2 مل من وسط نمو mESC إلى الطبق ، وقم برفع الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لعمل معلق خلية واحدة.
    6. احسب كثافة الخلايا في المعلق بأكبر قدر ممكن من الدقة باستخدام مقياس كثافة الدم.
    7. قسم الخلايا إلى 7 مجموعات وحث التمايز باستخدام بروتوكولات مختلفة موضحة في الجدول 1.

2. التمايز من mESCs إلى NPCs

  1. قم بإعداد ألواح أو أغطية لزراعة الخلايا المطلية بالجيلاتين بنسبة 0.1٪.
    1. قبل الاستخدام ، قم بإعداد ألواح أو أغطية 6 آبار مطلية بالجيلاتين بنسبة 0.1٪ كما في الخطوة 1.1.
  2. التمايز (الجدول 1)
    1. أضف 1.5 × 106 mESCs في طبق بكتيري غير لاصق في 10 مل من وسط التمايز القاعدي I للسماح بتكوين الجسم الجنيني عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪.
    2. بعد يومين ، قم بنقل مجاميع الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل واتركها تستقر عن طريق الجاذبية.
    3. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 10 مل من وسط التمايز القاعدي الطازج I لإعادة تعليق الأجسام الجنينية. أعد زرعها في طبق بكتيري جديد غير لاصق واسمح بالتمايز لمدة يومين آخرين.
    4. تحقق من تكوين الأجسام الجنينية تحت المجهر (الشكل 1 أ).
    5. اجمع الأجسام الجنينية كما هو موضح في الخطوات 2.2.2-2.2.3. قم بزرع حوالي 50 جسما جنينيا في 2 مل من وسط التمايز القاعدي I لكل بئر على 0.1٪ من ألواح 6 آبار مطلية بالجيلاتين.
    6. قم بإعداد 1 ملي مولار من حمض الريتينويك المتحول بالكامل (RA) (في DMSO) وتخزينها بعيدا عن الضوء في فريزر -80 درجة مئوية بعد التغليف الفرعي.
      ملاحظه: RA غير مستقر ، ويجب الانتباه إلى إبعاده عن الضوء وتقليل ملامسة الهواء أثناء تحضير مخزون RA.
    7. لتحريض التهاب المفاصل الروماتويدي ، أضف 2 ميكرولتر من مخزون RA في كل بئر لتكوين تركيز نهائي يبلغ 1 ميكرومتر.
    8. ضع اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية وقم بالتفريق لمدة 4 أيام أخرى.
    9. قم بتغيير 2 مل بالكامل من وسط التمايز القاعدي I (مع 1 ميكرومتر RA) كل يومين.

الجدول 1: تفاصيل البروتوكول المستخدم في التمايز.

بروتوكول وسائط تكوين الأجسام الجنينية لمدة 4 أيام + تحريض RA لمدة 4 أيام وسيط التمايز الأساسي:
DMEM / F12 + 15٪ FBS + 1٪ NEAA + 0.1 مللي متر 2ME + 1٪ P / S

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: مورفولوجيا الأجسام الجنينية. (أ) زراعة الأجسام الجنينية لمدة 4 أيام. (ب) الأجسام الجنينية المزروعة لمدة يومين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مكمل B-27 (50X) ، خال من المصل جيبكو 17504044 مخزنة في -20 درجة مئوية ، وتحمي من الضوء CHIR-99021 (CT99021) سيليك S1263 مخزنة في -20 درجة مئوية أغطية عش 801007 مصل الأبقار الجنينية HyClone SH30084.03 تخزينها عند -20 درجة مئوية ، وتجنب التجميد والذوبان المتكرر الجيلاتين جيبكو CM0635B مخزنة في درجة حرارة الغرفة مكمل GlutaMAX جيبكو 35050061 مخزنة في 4 درجات مئوية خروج المغلوب DMEM / F-12 جيبكو 12660012 مخزنة في 4 درجات مئوية استبدال مصل Knockout جيبكو 10828028 تخزينها عند -20 درجة مئوية ، وتجنب التجميد والذوبان المتكرر محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM جيبكو 11140076 مخزنة في 4 درجات مئوية ملحق N-2 (100X) جيبكو 17502048 يتم تخزينها في -20 درجة مئوية والحماية من الضوء الوسط العصبي القاعدي جيبكو 21103049 مخزنة في 4 درجات مئوية محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1X) HyClone SH30256.01 مليار مخزنة في 4 درجات مئوية محلول البنسلين / الستربتومايسين HyClone SV30010 مخزنة في 4 درجات مئوية PD0325901(ميردامتينيب) سيليك S1036 مخزنة في -20 درجة مئوية حمض الريتينويك سيغما R2625 يتم تخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية والحماية من الضوء سلالة 129 الخلايا الجذعية الجنينية للفأر سياجن MUAES-01001 يتم صيانتها في نظام الاستزراع الخالي من التغذية محلول التربسين 0.25٪ (1X) HyClone SH30042.01 مخزنة في 4 درجات مئوية 2-ميركابتو إيثانول جيبكو 21985023 يتم تخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية وتحمي من الضوء طبق ثقافة خلية 60 مم كورنينج 430166 أنبوب طرد مركزي 15 مل NUNC 339650

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة