عزل الخلايا عن العقد الحسية

الملخص

المصدر: Kaelberer ، M. M. ، et al. طريقة لاستهداف وعزل الخلايا العصبية الحسية المعصبة في مجرى الهواء في الفئران. (2016).

يوضح هذا الفيديو عزل الخلايا عن العقد الحسية للفئران. تتعرض العقد للهضم الأنزيمي لإذابة المصفوفة خارج الخلية. ثم يتم جمع الخلايا المفردة عن طريق الترشيح من خلال مصفاة خلية متبوعة بالطرد المركزي المتدرج للكثافة لإزالة الحطام. أخيرا ، يتم إجراء الغسيل والطرد المركزي لجمع الخلايا المعزولة لتحليلها في المستقبل.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. تفكك العقد الحسية

1. ماصة تخرج 500 ميكرولتر من محلول تفكك العقد (GaDS) (الجدول 1) ، تاركة العقد في الأنبوب. اغسل العقد مرة واحدة عن طريق إضافة 1 مل من محلول عازلة الفوسفات (PBS) ، وانتظر حتى تستقر العقد في قاع الأنبوب ، ثم قم بإخراج PBS.
2. أضف 1 مل من GaDS و 22 ميكرولتر من إنزيم الهضم (مزيج الكولاجيناز الأول / الثاني والبروتياز ، 2.5 مجم / مل في الماء) إلى كل أنبوب.
3. أضف 20 ميكرولتر Fast Blue (5.26 ملم) إلى أنبوب التحكم الموجب.
4. ضع الأنابيب في حمام مائي أو كتلة تسخين على درجة حرارة 37 درجة مئوية.
5. كل 15 دقيقة ، قم بهز الأنابيب لفترة وجيزة وقم بالنقر عليها للتأكد من تغطية العقد بالمحلول.
   ملاحظه: يعتمد وقت هضم العقد على عمر إنزيم الهضم. في غضون شهر واحد من إذابة إنزيم الهضم ، يهضم لمدة 30 دقيقة ؛ في غضون 2-6 أشهر ، هضم لمدة 45 دقيقة. إذا كان عمر الإنزيم أكثر من ستة أشهر ، فقم بهضم العقد لمدة 60 دقيقة.
6. أثناء هضم العقد ، قم بإعداد تدرجات الكثافة باستخدام محلول الجسيمات (جزيئات السيليكا الغروية المغلفة بالبولي فينيل بيروليدون).
7. امزج محلول الجسيمات بنسبة 12٪ في GaDS ، 500 ميكرولتر لكل عينة.
8. امزج محلول الجسيمات بنسبة 28٪ في GaDS ، 500 ميكرولتر لكل عينة.
9. أضف ببطء وحذر 400 ميكرولتر محلول كثافة 12٪ فوق محلول كثافة 400 ميكرولتر 28٪ في أنبوب جديد سعة 1.5 مل لكل عينة. لا تسمح للطبقتين بالاختلاط. يجب أن تكون طبقتان متميزتان مرئيتين في الأنبوب ، إحداهما أغمق من الأخرى.
10. بعد وقت الهضم المناسب ، قم بإزالة GaDS بإنزيم الهضم واغسل العقد مرتين باستخدام 1 مل PBS. أضف 200 ميكرولتر من GaDS الطازج إلى كل أنبوب.
11. استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر، مضبوطة على حجم 100 ميكرولتر، وعقد الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لتفكيك الخلايا. كرر حتى لا ترى قطعة سليمة من الأنسجة. تجنب تكوين فقاعات في المحلول.
12. مرر الخلايا المنفصلة عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر.
13. أضف 100 ميكرولتر أخرى من GaDS إلى أنبوب التفكك الأصلي لالتقاط أي خلايا طائشة متبقية وتمرير المحلول الإضافي عبر مصفاة الخلية. باستخدام طرف ماصة جديد، اجمع أي سائل متبقي يحتوي على خلية مر عبر المصفاة وتشبث بالشبكة. الحجم النهائي للخلايا المعلقة في GaDS هو 300 ميكرولتر.
14. ضع طبقة بعناية من 300 ميكرولتر من الخلايا فوق تدرج الكثافة الذي تم إنشاؤه مسبقا. تجنب الفقاعات واختلاط الخلايا بطبقات الكثافة.
15. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 2,900 × جم عند RT.
16. بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، قم بإزالة الطبقة العلوية 700 ميكرولتر والتخلص منها بعناية. تحتوي هذه الطبقة على غالبية بقايا الخلية التي ستتداخل مع فرز الخلايا.
17. أضف 700 ميكرولتر من GaDS الطازج إلى الخلية المتبقية التي تحتوي على محلول والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للخلط.
18. 18. جهاز الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 2,900 × جم لخلايا الحبيبات.
19. 19. بمجرد الانتهاء من الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية والتخلص منها ، تاركة حبيبات الخلية.
20. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 - 300 ميكرولتر GaDS عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 1,000 ميكرولتر مضبوطة على 200 ميكرولتر عدة مرات. ضع عينات على الجليد.

< p class = "jove_content" > الجدول 1. خليط الكاشف لمحلول تفكك العقد (GaDS).

العنصر مبلغ DMEM / f12 المتقدم 9.5 مل الجلوتامين 100 ميكرولتر HEPES (10 ملم) 100 ميكرولتر مكمل N2 100 ميكرولتر ب 27 (بدون فيتامين أ) 200 ميكرولتر NGF (50 ميكروغرام / مل) 10 ميكرولتر

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (PBS) خال من الكالسيوم والمغنيسيوم جيبكو 14190-144 DMEM / F12 المتقدم جيبكو هاتف: 12634-010 الجلوتامين (جلوتاماكس) جيبكو 35050-061 هيبس جيبكو هاتف: 15630-080 N2 جيبكو 17502-048 ب 27 (بدون فيتامين أ) جيبكو هاتف: 12587-010 عامل نمو الأعصاب (NGF) سيغما N6009 مخزون 50 ميكروغرام / مل في PBS / 10٪ FBS إنزيم الهضم ، درجة أبحاث Liberase DH روش 5401054001 مخزون 2.5 مجم / مل في الماء محلول الجسيمات (بيركول) سيغما P1644-25 مل كتلة التدفئة لابنت مصفاة خلية 70 ميكرومتر صقر هاتف: 352350