طريقة أنبوب الأسطوانة المعدلة للثقافة طويلة الأمد لشرائح دماغ القوارض

الملخص

المصدر: Fixman ، B. B. ، et al. طريقة أنبوب الأسطوانة المعدلة للتصوير المتقطع الموضعي والمتكرر بدقة أثناء الثقافة طويلة المدى لشرائح الدماغ في نظام مغلق. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو طريقة أنبوب أسطواني معدلة لزراعة شرائح الدماغ على المدى الطويل من نموذج القوارض. أولا ، يتم إرفاق شرائح الدماغ بطبقات الأغطية. بعد ذلك ، يتم أخذ أنابيب الأسطوانة ذات الجوانب المسطحة ذات الفتحة على الجانب المسطح ، ويتم وضع أغطية الغطاء على الفتحة باستخدام أقراص لاصقة. أخيرا ، يضاف وسط مغذي وثاني أكسيد الكربون وخليط الهواء إلى الأنبوب ، ويتم تحضين الأنابيب بحركة متدحرجة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

ملاحظة: يصف البروتوكول أدناه طريقة التحضير والثقافة للحضانة طويلة الأمد والتصوير المتقطع لشرائح الحصين. يتم إرفاق شريحة حصين واحدة بغطاء محفور ضوئي معد خصيصا باستخدام جلطة بلازما ، ثم يتم إغلاق الغطاء على الجانب المسطح من أنبوب أسطواني محفور ، والذي يتم صيانته في حاضنة أسطوانة.

فئة

1. تحضير رف أنبوب الأسطوانة

1. استخدم القالب الموضح في الشكل 1 أ المطبوع بالحجم الموضح على شريط المقياس. باستخدام مسمار ، قم بعمل ثقوب صغيرة (كبيرة بما يكفي لعلامة نقطة دقيقة) في القالب المتمركز على الثقوب.
2. ضع القالب في الجزء السفلي من طبق زراعة الأنسجة مقاس 15 سم (القطر الاسمي 14 سم) وحدد موضع الثقوب. كرر هذا على طبق ثان.
3. باستخدام لقم الثقب المصممة للاستخدام على البلاستيك ، قم بحفر ستة ثقوب قطرها 1.5 سم على كل طبق في مجموعة سداسية (4.8 سم من المنتصف إلى المركز) مع مراكز ثقب على بعد 2.5 سم من حافة الطبق. قم بحفر ثلاثة ثقوب (قطرها 3 مم) 12 مم من الحافة يتم وضعها على مسافة متساوية بين اثنين من الثقوب الأكبر كما هو موضح في الشكل 1 أ.
4. مع مواجهة قيعان كل طبق لبعضها البعض ، ضع برغي آلة بطول 2.5 بوصة (قطر 3/16 بوصة) مع غسالة مسطحة من خلال أحد الثقوب الصغيرة متبوعة بغسالة مسطحة ثانية ، قطعة من أنابيب البولي إيثيلين (فاصل ، 4.7 سم) ، غسالة مسطحة أخرى ، طبق ثقافة الأنسجة الثاني ، غسالة مسطحة أخرى ، غسالة قفل ، والجوز.
5. كرر الخطوة 1.4 على المسمارين الآخرين للماكينة وقم بإحكام ربطها بشكل غير محكم فقط حتى تصبح جميع براغي الماكينة في مكانها. ثم شد المكسرات بإحكام.
6. قم بعمل الحلقات (بسمك 5/16 بوصة ، قطر ثقب 5/8 بوصة) في فتحات الطبق السفلي للحصول على رف أنبوب الأسطوانة النهائي (الشكل 1 ب ؛ كما هو موضح مع أنبوبين في مكانهما). ضع ملصقا على كل رف برقم فريد.

فئة < p = "jove_title" >2. تحضير أنابيب الأسطوانة والأغطية

1. صنع الرقصة لحفر الثقب في أنابيب الأسطوانة
   1. قم بحفر حفرة 1.5 سم بعمق 8 سم في الجانب الأوسط من كتلة خشبية مقاس 2 × 4 × 5.5 بوصة بزاوية بحيث يكون الجانب المسطح من أنبوب الأسطوانة موازيا تقريبا للكتلة عند إدخالها (الشكل 2 أ).
   2. قم بتكبير الفتحة باستخدام ملف خشبي دائري لتوسيع الفتحة وتقليلها للسماح بإدخال الأنبوب (قطر الأنابيب الدوارة أكبر قليلا بالقرب من نهاية الغطاء) (الشكل 2 ب).
   3. احفر حفرة رأسية قطرها 1.5 سم ، 5.5 سم من جانب الكتلة ، وتوسيطها فوق الفتحة الجانبية (الشكل 2 ج).
   4. عندما يكون الثقب الجانبي مدببا بدرجة كافية ، أدخل أنبوبا أسطوانيا محددا في المكان المطلوب لتوسيط الفتحة للشريحة ووضع الأنبوب بحيث يتم توسيط البقعة المحددة في الفتحة الرأسية 1.5 سم.
   5. قم بإزالة الأنبوب وقياس المسافة من البقعة إلى نهاية الأنبوب. ضع علامة على هذه المسافة من مركز الفتحة في الرقصة وأدخل مسمارا لتوفير توقف لوضع الأنبوب بشكل صحيح للحفر (السهم في الشكل 2C).
   6. استخدم منشارا لقطع الظفر مع سطح الكتلة الخشبية لمنع الإصابة.
   7. أضف مشابك زنبركية في الجزء السفلي من الرقصة إذا كان هناك مكبس حفر مع فتحات تسمح بتثبيته (الشكل 2D سهم أسود). خلاف ذلك ، استخدم المشابك C لتثبيت الرقصة بإحكام على مكبس الحفر.
2. باستخدام الرقصة الموضحة أعلاه لتثبيت ووضع أنبوب ثقافة بلاستيكي مسطح الجوانب مقاس 11 سم مع الجانب المسطح لأعلى (الشكل 2 أ) ، قم بحفر ثقب قطره 6 مم مع المنتصف 1.0 سم من الأسفل ومركزه بين جانبي الأنبوب.
   ملاحظه: يجب استخدام مثقاب مصمم للبلاستيك.
3. باستخدام أداة إزالة الحواف الدوارة ، قم بتنعيم حواف الفتحة (الشكل 2E) وقم بعمل 4 أخاديد على الحافة الداخلية للفتحة (الشكل 2E ، داخلي) لتسهيل تصريف الحفرة أثناء الدوران.
4. باستخدام ثقب 12 مم ، قم بقطع الأقراص بقطر 12 مم من صفائح مطاطية من السيليكون اللاصقة على الوجهين غير السامة. باستخدام ثقب ورقي قياسي بفتحة واحدة (قطر 6 مم) ، قم بعمل ثقب في وسط كل قرص.
5. اشطف الأنابيب المحفورة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وجففها بالهواء في خزانة أمان بيولوجية ، وقم بتعقيم الأنابيب والأقراص اللاصقة المثقوبة لمدة 40 دقيقة تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية (30 واط بمتوسط مسافة 70 سم) في خزانة السلامة البيولوجية.
6. أعد وضع الأنابيب والأقراص بعد 20 دقيقة بحيث يتم تعقيم جميع الأسطح المكشوفة. في ظل ظروف معقمة ، انزع الدعامة البيضاء من قرص لاصق وقم بتثبيت مطاط السيليكون على السطح الخارجي للأنبوب ، ومحاذاة الثقوب (الشكل 2F).
   أنذر: لتجنب التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، ارتد واقيا للعين وأغلق الخزانة قبل تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية.
7. نظف أغطية زجاجية ألمانية بقطر 12 مم محفورة ضوئيا (100 مربع مرقمة بمركز 1 مم). امسك الغطاء برفق باستخدام ملقط واغمس في الإيثانول المطلق ، متبوعا بالماء ، متبوعا بالإيثانول المطلق مرة أخرى ، وأخيرا اغمس الغطاء في اللهب لحرق الإيثانول. اترك أغطية لتبرد.
8. أمسك الغطاء بالملقط ، واغمس في 2٪ 3-aminopropyltriethoxysilane في الأسيتون لمدة 10 ث. اشطف الغطاء بالماء فائق النقاء واتركه حتى يجف في الهواء.
9. ضع أغطية الغطاء على ورق ترشيح معقم داخل خزانة السلامة البيولوجية وقم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية. اكشف كل جانب من جوانب الغطاء لمدة 20 دقيقة < / > أنذر: لتجنب التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، ارتد واقيا للعين وأغلق الخزانة قبل تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية.

< p class = "jove_title" >3. تحضير شريحة الحصين

1. قبل البدء في التشريح ، قم بإعداد نصفين من شفرات الحلاقة ذات الحدين لمفرمة الأنسجة. قم بطي الشفرات بالطول بعناية بأصابعك وقم بتثبيتها إلى النصف.
2. اشطف نصفي الشفرة بالأسيتون باستخدام قطعة قطن لتنظيفها ، متبوعا بالشطف بالإيثانول المطلق والتجفيف بالهواء. قبل تركيب نصف شفرة على مفرمة المناديل ، قم بتعقيمها عن طريق شطفها بنسبة 70٪ من الإيثانول.
3. اتبع البروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدامه المؤسسية ؛ بعد تخدير الأيزوفلوران ، قتل جرو فأر أو جرذ عمره 4-7 أيام عن طريق قطع الرأس وإزالة الرأس بالمقص أو المقصل><ة. ملاحظه: بروتوكول ثقافة شريحة الدماغ مستقل عن سلالة الفأر أو الفئران أو النمط الجيني. تم استخدام العديد من خطوط الفئران المعدلة وراثيا ذات الخلفيات الجينية المختلفة.
4. اشطف الرأس بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وضعه في طبق بتري 60 مم. حتى التركيب النهائي لشريحة الدماغ على أنبوب الأسطوانة ، يتم تنفيذ جميع الخطوات التالية في غطاء التدفق الصفحي للحفاظ على العقم.
5. باستخدام شفرة جراحية # 21 ، قم بعمل قطع سهمي عبر الجلد والجمجمة. باستخدام ملقط دومون # 5 ، قشر الجلد والجمجمة لفضح الدماغ.
6. باستخدام ملقط مغلق ، قم بإخراج الدماغ بالكامل برفق ، وأطلقه عن طريق الضغط بالملقط عبر جذع الدماغ خلف المخيخ. ضع الدماغ في طبق معقم مقاس 60 مم يحتوي على 4 درجات مئوية من محلول الملح المتوازن من Gey's / 0.5٪ جلوكوز (GBSS / الجلوكوز).
7. باستخدام مجهر تشريح لتصور الدماغ (الشكل 3 أ) ، ضع الجانب الظهري للدماغ لأعلى واقطع الثلث الأمامي من الدماغ والمخيخ بشفرة جراحية (الشكل 3 ب).
   1. باستخدام الملقط ، أمسك الجانب الخلفي للدماغ المشذب لأعلى والجانب البطني على جانب طبق بتري لتحقيق الاستقرار. قم بإزالة السحايا برفق حول خط الوسط السهمي وإزالة أنسجة الدماغ الأوسط باستخدام ملقط دومون # 5 ذو رأس ناعم (الشكل 3 ج ، دائرة متقطعة).
   2. قم بعمل قطعتين على طول جانب الدماغ لنشره مفتوحا (الشكل 3C ، خطوط متقطعة). بمجرد وضع الجانب الظهري للدماغ لأسفل وانتشاره مفتوحا ، يجب أن يكون شق الحصين مرئيا (الشكل 3D ، السهم).
   3. انقل الدماغ المفتوح المنتشر إلى قطعة من فيلم بلاستيكي متعدد الكلورو ثلاثي فلورو إيثيلين وضعه للتقطيع على مرحلة مفرمة الأنسجة. بلل الشفرة ب GBSS / الجلوكوز وقطع الحصين إلى شرائح بسمك ~ 300 ميكرومتر.
   4. باستخدام ماصة النقل ، اغسل شرائح الدماغ من الطبقة البلاستيكية في طبق جديد مقاس 60 مم يحتوي على GBSS / الجلوكوز (الشكل 3E). قم بقرص السحايا المتبقية والأنسجة الأخرى غير الحصين (الشكل 3F) من الشرائح (الشكل 3G ، H) وإزالتها ، باستخدام ملقط ناعم ، وقم بإزالتها.

فئة < p = "jove_title" >4. شرائح الطلاء

1. بمجرد الحصول على الشرائح ، ضع 2 ميكرولتر من بلازما الدجاج في منتصف الجانب المحفور ضوئيا من الغطاء المعد. انشر البلازما قليلا للحصول على بقعة قطرها 3-4 مم.
   ملاحظه: الجانب المحفور ضوئيا هو الجانب العلوي من الغطاء عند عرضه من خلال مجهر تشريح بحيث يتم توجيه الأرقام بشكل صحيح.
2. انقل شريحة دماغية واحدة بملعقة معقمة ضيقة الطرف (الشكل 4 أ) إلى بقعة البلازما (الشكل 4 ب). استخدم ملقطا مغلقا للحفاظ على الشريحة على طرف الملعقة أثناء رفع الشريحة من GBSS / الجلوكوز.
3. المس الملعقة ببقعة البلازما على الغطاء ، وباستخدام ملقط مغلق ، ادفع الشريحة على الغطاء.
4. امزج 2.5 ميكرولتر من البلازما مع 2.5 ميكرولتر من الثرومبين في أنبوب منفصل. ضع بسرعة 2.5 ميكرولتر من هذا الخليط فوق الشريحة وحولها وقم بسحب الماصة لأعلى ولأسفل برفق لخلطها (الشكل 4 ب).
   ملاحظه: سوف تتخثر البلازما في غضون 10-15 ثانية ، لذلك يجب أن يتم ذلك بسرعة. إذا كان التصاق الشريحة يمثل مشكلة ، فقم بخلط 5 ميكرولتر من البلازما مع 5 ميكرولتر من الثرومبين واستخدم 4-5 ميكرولتر على الشريحة ، وقم بإزالة بعضها بعد الخلط بحيث تكون الشريحة مسطحة على الغطاء.
5. قم بإزالة الغطاء البلاستيكي الشفاف من الجانب المكشوف من لاصق مطاط السيليكون الذي تم تثبيته مسبقا على أنبوب أسطواني وضع الغطاء مع شريحة الدماغ على المادة اللاصقة لمحاذاة الشريحة داخل الفتحة (الشكل 4C).
6. لضمان الالتصاق ، قم بالضغط الناعم والمتساوي على الغطاء بالإبهام عن طريق الضغط على الغطاء لأسفل بالتساوي والاحتفاظ به لمدة 1 دقيقة تقريبا أثناء نقله إلى خزانة السلامة البيولوجية.
7. في خزانة السلامة البيولوجية ، أضف 0.8 مل من وسط الثقافة العصبي القاعدي A الكامل (جدول المواد) إلى كل أنبوب (الشكل 4 د).
8. قم بتدفق خليط هواء بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون_{بنسبة 2}/95٪ من خلال ماصة باستور معقمة مسبوطة بالقطن مثبتة بإحكام بواسطة مشبك. اغسل أنبوب الأسطوانة بخليط الغاز وقم بتغطية الأنبوب بسرعة أثناء سحبه من حول الماصة.
9. قم بتسمية الأنابيب برقم الشريحة ورقم الرف. أدخل الأنابيب في رف الأسطوانة ، مع التأكد من أنها متوازنة هندسيا. إذا كان هناك عدد فردي من الأنابيب ، فأضف الأنابيب لتحقيق التوازن.
10. ضع الرفوف في حاضنة أسطوانية 35 درجة مئوية مع بكرات تدير رف الأسطوانة بحوالي 10-13 دورة في الساعة (RPH) (الشكل 4E). للحفاظ على الوسيط في الجزء السفلي من الأنابيب ، قم بإمالة الحاضنة للخلف بمقدار 5 درجات تقريبا عن طريق رفع أمامها على لوحة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تحضير رف أنبوب الأسطوانة. (أ) قالب لتمييز مواضع الثقب لحفر قيعان أطباق زراعة الأنسجة مقاس 15 سم. إذا تمت طباعة الشكل بحجم شريط المقياس الموضح ، فيمكن قصه واستخدامه لتمييز المواضع على طبق ثقافة مقاس 15 سم لحفر الثقوب المعروضة. (ب) اكتمل رف أنبوب الأسطوانة مع إدخال أنبوبين. يتم ترقيم كل رف على ملصق يمكن رؤيته بسهولة في الجزء العلوي من الرف.

<...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات قيعان من أطباق ثقافة 15 سم VWR العلمية هاتف: 25384-326 مسامير آلة فيليبس (# 10-32) أجهزة الآس 2.5 بوصة طول وقطر 3/16 بوصة غسالات مسطحة # 10 أجهزة الآس آلة الصواميل اللولبية (# 10-32) أجهزة الآس حلقات مطاطية أجهزة الآس 5/16 "، سميكة ؛ 5/8 "، قطر الثقب ؛ 1.125 "، OD أنابيب البولي إيثيلين (5/16 بوصة ؛ OD ، 3/16 "؛ الهوية) أجهزة الآس قطع إلى طول 1.8 بوصة غسالة القفل # 10 أجهزة الآس مكبس الحفر ، 5 سرعات أجهزة الآس Nunclon دلتا أنابيب مسطحة الجوانب VWR 62407-076 لقم الثقب ، 3 مم ، 6 مم ، 15 مم أجهزة الآس ماركة ديابلو فرويد لقم الثقب لقطع البلاستيك لقم ثقب للخشب ، 1.5 سم و 1 مم أجهزة الآس ملف خشبي ، 1/4 "دائري أجهزة الآس مشابك زنبركية، حامل كبس 16 مم أجهزة الآس أداة إزالة الحواف ذات الرأس الدوار ، 5 " أجهزة الآس هاتف: 26307 ورقة سيليكون لاصقة (ختم آمن) جريس بيو لابز 666581 سمك 0.5 مم ثقب ثقب 6 مم مكتب ماكس ثقب ثقب 12 مم thepunchbunch.com 70٪ إيثانول أغطية فوتوتيكيد بقطر 12 مم شركة بيلكو للزجاج بنسن المووقد الإيثانول المطلق مياه نانو نقية 3-أمينوبروبيل تري إيثوكسيلين سيجما ألدريتش أ3648 أسيتون سيجما ألدريتش 179124 # 5 ملقط دومون أدوات العلوم الدقيقة 11251-30 ماكلوين مروحية مناديل تيد بيلا ، إنك. 10180 شفرات حلاقة مزدوجة الحواف تيد بيلا ، إنك. 121-6 ورق ترشيح Whatman VWR هاتف: 28450-182 مقطعة إلى دوائر قطرها 5.8 سم بولي كلورو ثلاثي فلورو إيثيلين (أكلار) تيد بيلا ، إنك. 10501-10 مقطعة إلى دوائر قطرها 5.8 سم # 21 شفرة جراحية VWR العلمية هاتف: 25860-144 # 5 ملقط دومون أدوات العلوم الدقيقة 11251-30 ملعقة، غير قابلة للصدأ بنهاية مدببة VWR 82027-518 محلول الملح المتوازن من Gey's سيجما ألدريتش جي 9779 الجلوكوز ثيرموفيشر العلمي 15023-021 محلول 25٪ (وزن / حجم) ، فلتر 0.2 مم معقم بلازما دجاج كوكاليكو بيولوجيكس 30-0300-5 لتر أعد الترطيب في الماء المعقم ، وجهاز الطرد المركزي عند 2500 × جم 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، والتجميد السريع في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية. الثرومبين الموضعي (البقري) شركه فايزر الثرومبين - JMI يتم تجميد كميات سريعة في النيتروجين السائل عند 1,000 وحدة دولية / مل في المادة المخففة المتوفرة وتخزينها عند -80 درجة مئوية. نظام الأسطوانة الخلوية بيلكو للتكنولوجيا الحيوية SciERA حاضنة الأسطوانة فورما الموديل: 3956