بدء التمديد السريع للعصبية وتشكيلها الوصلات العصبية الوظيفية

الملخص

المصدر: M. H. Magdesian et al. ، إعادة توصيل الدوائر العصبية: طريقة جديدة لتمديد العصبية السريع والاتصال العصبي الوظيفي ، J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو تقنية للبدء السريع للخلايا العصبية وتمددها وإنشاء اتصالات جديدة مع خلية عصبية مستهدفة باستخدام جهاز الموائع الدقيقة والمعالجة الدقيقة. يمكن استخدام هذا للعلاجات التي تهدف إلى إعادة توصيل الدوائر العصبية بعد الصدمة أو في الأمراض التنكسية العصبية.

البروتوكول

1. توحيد الثقافات العصبية باستخدام أجهزة الموائع الدقيقة: تجميع الجهاز

1. حدد جهاز الموائع الدقيقة المناسب للتجربة المطلوبة. لربط الخلايا العصبية داخل نفس السكان ، استخدم الأجهزة العصبية (الشكل 1) ، ولربط الخلايا العصبية في مجموعات سكانية مختلفة ، استخدم أجهزة الزراعة المشتركة (الشكل 2).
2. قم بتنظيف وإعداد العدد المطلوب من أغطية معقمة أو أطباق القاع الزجاجي. للحصول على أفضل النتائج على الأسطح البلاستيكية ، استخدم أطباق مقاس 35 مم ، على الزجاج ، استخدم أغطية مقاس 25 مم أو أطباق ذات قاع زجاجي مقاس 35 مم. حدد سمك الزجاج بناء على نظام التصوير ، على سبيل المثال ، 0.15 مم.
3. قم بتغطية الأطباق أو الغطية ب 0.5-1 مل من 100 ميكروغرام / مل PDL لمدة ساعتين أو طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا واستئنافه في اليوم التالي إذا رغبت في ذلك. علاوة على ذلك ، يمكن تغليف الأطباق ب PDL المخفف بالبورات أو Poly-L-Lysine (PLL) أو اللامينين أو أي جزيء التصاق خلوي آخر.
4. اغسل الأطباق مرتين بالماء (لا تستخدم المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) لأن بلورات الملح قد تسد القنوات) ، وقم بإزالة كل السائل واتركه يجف في بيئة معقمة مثل خزانة السلامة الحيوية لمدة 5-10 دقائق أو حتى يجف السطح تماما.
   ملاحظه: احرص على التأكد من أن الغطاء جاف تماما ، لأن أي سائل متبقي سيتداخل مع التصاق أنظمة الموائع الدقيقة.
5. ضع أجهزة الموائع الدقيقة ذات الأنماط المتجهة لأعلى تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في بيئة معقمة (خزانة السلامة الحيوية) لمدة 10 دقائق. تأكد من اتباع الإجراءات المعقمة عند العمل في خزانة السلامة البيولوجية10.
6. باستخدام الملقط ، ضع جهازا مائعا دقيقا بنمط متجها لأسفل عند ملامسة الغطاء / الطبق النظيف. استخدم الملقط للضغط برفق على الجهاز حتى يلتصق بالزجاج.
   ملاحظه: ستكون شفافية المنطقة الملتصقة مرئية عند النظر إلى الضوء. تأكد من أن جميع الزوايا ملامسة للزجاج. افعل ذلك لجميع أجهزة الموائع الدقيقة. انظر الشكل 1 أ.
7. لملء الجهاز الفردي بالوسط ، وجه الماصة نحو القنوات وأضف 50 ميكرولتر من وسط الخلية الكامل المكمل ب B-27 الخالي من المصل (نسبة الحجم 1:50) و 500 ميكروغرام / مل البنسلين / الستربتومايسين / الجلوتامين (يسمى مجتمعة NBM) إلى البئر العلوي الأيمن ، ثم أضف 50 ميكرولتر أخرى إلى البئر الملقى قطريا عليه. افعل ذلك لجميع الأجهزة ، مع التأكد من تدفق الوسط بين الآبار. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولتر من المتوسط إلى البئرين المتبقيين. انظر الشكل 3 أ.
   1. لملء الجهاز متعدد الكثافة بالوسط ، وجه الماصة نحو القنوات وأضف 30 ميكرولتر من NBM الكامل إلى الآبار اليمنى ، راجع الشكل 2 أ. افعل ذلك لجميع الأجهزة ، مع التأكد من تدفق الوسط بين الآبار. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولتر من المتوسط إلى الآبار الأربعة المتبقية.
8. ضع الأجهزة في طبق أكبر مع طبق مفتوح به ماء معقمة (غرفة مبللة) وضعها في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2 ،} و 95٪ رطوبة) لمدة 1-2 ساعة أثناء تحضير زراعة الخلايا. انظر الشكل 3 ب.

فئة

2. طلاء الخلايا العصبية في أنظمة الموائع الدقيقة

1. باتباع بروتوكول ، احصل على الخلايا العصبية الحصين أو القشرية المنفصلة من أجنة الفئران Sprague Dawley (أي من الجنسين).
2. إعادة تعليق الخلايا العصبية الجنينية في NBM بتركيز 1-2 مليون خلية عصبية / مل. تحقق من تركيزات الخلايا في المجهر باستخدام مقياس كثافة الدم والمرجع التالي8. اضبط تركيز الخلية وفقا لكثافة الخلية المطلوبة. لزيادة فرص الحصول على محاور الحصين المفردة لكل قناة ، لوحة 10,000 خلية عصبية لكل جهاز. للحصول على محاور متعددة في نفس القناة ، قم بلوحة 60,000 خلية عصبية لكل جهاز.
   ملاحظة: تختلف هذه الأرقام وفقا لنوع الخلايا العصبية المستخدمة.
3. قم بإزالة الوسيط من أجهزة الموائع الدقيقة دون إفراغ الآبار. اترك ما يقرب من 5 ميكرولتر في كل منهما.
4. لصفيحة الخلايا في جهاز السكان الفردي ، أضف 50 ميكرولتر من NBM إلى البئر السفلي الأيمن. في هذه المرحلة ، يتدفق الوسيط من تلقاء نفسه لملء البئر السفلي الآخر. أضف 20 ميكرولتر من محلول الخلية المركزة في البئر العلوي الأيمن لجهاز الموائع الدقيقة ، كما هو موضح في الشكل 1 ب.
   1. لصفيحة الخلايا في الجهاز متعدد السكان ، أضف 20 ميكرولتر من محلول الخلية المركزة في كل بئر من الآبار الصحيحة في الشكل 2 أ.
5. تحقق في المجهر إذا كانت الخلايا داخل الغرف وضع الأجهزة في الحاضنة لمدة 15-30 دقيقة لتعزيز ارتباط الخلية بالركيزة.
6. تحقق في المجهر إذا كان هناك عدد كاف من الخلايا في الغرف. إذا كانت هناك حاجة إلى المزيد، كرر الخطوتين 2.4 و 2.5.
7. أضف 50 ميكرولتر من NBM إلى الآبار العلوية للجهاز السكاني الفردي و 20 ميكرولتر من NBM في نفس البئر الذي تم حقنه في الجهاز متعدد السكان. تبرز الوسائط قليلا لتشكيل الغضروف المفصلي الإيجابي مما يمنح الآبار جانبا عليا للكعك. مرة أخرى ، انظر الشكل 3 أ.
8. حافظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ و 95٪ رطوبة.

< p class = "jove_title" >3. الحفاظ على الثقافات العصبية

1. قم بإزالة NBM (حوالي 30 ميكرولتر مع ماصة) من الخلايا وقم بتطبيق NBM جديد مسخن مسبقا في اليوم التالي لإدخالها إلى الأجهزة (أي 1 د بعد الخطوة 2).
2. تحقق كل يومين إذا كان هناك وسيط كاف في كل قناة. إذا كان سطح الكعك منخفضا ، فما عليك سوى إضافة المزيد من المتوسط إلى الآبار العلوية.
3. خلايا الزراعة لمدة 7 أيام على الأقل قبل إزالة أجهزة الموائع الدقيقة. يمكن للخلايا البقاء على قيد الحياة في هذه الأجهزة لعدة أسابيع. قم بإزالة الأجهزة قبل 1-2 أيام من إجراء التجارب على العينات.

< p class = "jove_title" >4. إزالة أجهزة الموائع الدقيقة

1. 1 - 2 د قبل إزالة الأجهزة الموائع الدقيقة ، أضف 2 مل من NBM المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية إلى كل طبق عينة ، مما يؤدي إلى إغراق الغرف ، والحفاظ على الأجهزة في الحاضنة.
2. استخدم ملاقط معقمة وطرف واحد لإزالة أجهزة الموائع الدقيقة من الغطاء تاركا تكوينا منقوشا من الخلايا العصبية. استخدم الطرف لتثبيت الغطاء في مكانه والملاقط لإمساك حافة الجهاز في الزاوية اليسرى السفلية من البئر. قم بتطبيق الالتواء بدقة ، ورفع الجهاز مع الملقط بحيث يتقشر الغطاء. انظر الشكل 3 ج-3 د.
3. كل 2-3 أيام ، استبدل نصف NBM حتى يتم استخدام العينة للتجارب.
4. قبل إجراء تجارب إعادة الأسلاك على العينة ، تحقق من عزل الخلايا العصبية في قنوات الجهاز السكاني الفردي ومجموعات الخلايا العصبية في الجهاز متعدد السكان عن طريق فحص الفجوات بينهما في المجهر للتأكد من عدم وجود خيوط تربط مجموعات الخلايا العصبية.

فئة

5. تحضير الخرز المطلي ب PDL

1. أضف قطرتين 2 × 50 ميكرولتر من حبات البوليسترين 4 أو 10 أو 20 ميكرومتر المخففة في الماء (1: 500) إلى 1 مل من PDL (100 ميكروغرام / مل). اتركيه لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا واستئنافه في اليوم التالي.
2. جهاز الطرد المركزي المحلول عند 8,820 × جم لمدة 1 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الخرزات المتراكمة في قاع الحاوية.
3. اغسل الخرزات مرتين ب 1 مل من محلول HEPES المعقم 10 ملي مولار 8.4.
4. أعد تعليق الخرزات المطلية ب PDL في 200 مل من محلول HEPES pH 8.4 10 ملي.

< p class = "jove_title" >6. تحضير الماصات الدقيقة

1. قم بإعداد الماصات من الأنابيب الشعرية الزجاجية (القطر الداخلي 1 مم، القطر الخارجي 1.5 مم) باستخدام مجتذب قطب كهربائي أفقي. اضبط الإعدادات بحيث يكون الطرف الخارجي للماصة الدقيقة المسحوبة ~ 2-5 ميكرومتر. قبل السحب ، تأكد من نظافة الأنابيب الزجاجية.
2. قم بتثبيت الماصات على الشرائح الزجاجية للتخزين، وتأكد من أن الطرف لا يلامس سطح الشريحة لأن الطرف هش. يحفظ في درجة حرارة الغرفة في وعاء مغطى للحماية من الغبار. استخدم الماصات في نفس يوم سحبها.

فئة

7. التصاق حبة PDL بالخلايا العصبية

1. أضف 40-60 ميكرولتر من الخرز المطلي ب PDL المحضر في الخطوة 5 إلى مزرعة الخلية المعدة في الخطوة 4. قم بتوسيط طرف الماصة فوق الخلايا العصبية ، والتي تكون مرئية بشكل خافت على الغطاء ، وأضف الخرزات (انظر الشكل 4).
2. أعد العينة إلى الحاضنة لمدة 1 ساعة لتعزيز تكوين جهات الاتصال المتشابكة.
3. بعد الحضانة ، قم بإزالة أي حبات غير ملتصقة عن طريق غسل المزرعة برفق باستخدام NBM الدافئ مسبقا.

< p class = "jove_title" >8. تحضير محلول ملحي فسيولوجي (لتجارب درجة حرارة الغرفة)

1. تحضير محلول ملحي فسيولوجي. هذا لتنظيم بيئة الخلية خارج الحاضنة.
2. تحقق من مستويات الأسمولية والأس الهيدروجيني.
3. قم بنقع المحلول باستمرار مع O₂ لتقليل تقلبات الأس الهيدروجيني أثناء إجراء التجارب.
4. تسخين إلى درجة حرارة الغرفة.
5. قم بإعداد نظام التروية عن طريق إدخال أحد طرفي أنبوب بلاستيكي (أبعاد اختيارية) في محلول فسيولوجي مملوء ب O₂ وتثبيت الطرف الآخر بإبرة يتم إدخالها في حامل العينة. ضع الأنبوب والمحلول أعلى من العينة (انظر الشكل 5).
   1. افصل الأنبوب عن الإبرة وقم بتوصيله بحقنة. استخدم المحقنة لممارسة الضغط وسحب السائل ، وملء الأنبوب. ختم مع المشبك الأسطوانة وإعادة توصيل الإبرة.

< p class = "jove_title" >9. حبة التلاعب الدقيق

1. قم بتثبيت العينة في إعداد تجريبي بحيث يمكن الوصول إلى الخلايا من الأعلى بواسطة ماصتين دقيقتين مثبتتين في معالجات دقيقة والوصول إليها بصريا أدناه ، على سبيل المثال ، مع هدف 40X (الفتحة العددية 0.6) للمجهر البصري المقلوب. في هذا التكوين ، قم بتركيب كاميرا CCD لالتقاط الصور على المنفذ الجانبي للمجهر. قم بتوصيل كل ماصة بمحاقن سعة 1 مل عبر أنابيب بلاستيكية. في هذه الخطوة ، استبدل NBM بمحلول ملحي فسيولوجي (1-2 مل) (انظر الشكل 5).
2. أثناء التجارب ، يتم تخلل الخلايا باستمرار بالمحلول الملحي الفسيولوجي المحضر في الخطوة 8 بمعدل 0.5-1 مل / دقيقة.
3. حدد حبة PDL غير متصلة بخلية عصبية في مجال الرؤية. قم بمحاذاة الخرزة بطرف ماصة دقيقة من خلال التركيز على الخرزة ثم حتى الماصة الدقيقة. قم بإنزال الطرف بالقرب من الخرزة قدر الإمكان عن طريق مراقبتها من خلال المجهر.
4. استخدم ضغطا سلبيا باستخدام المحقنة سعة 1 مل المتصلة بالماصة لالتقاط الخرزة. حافظ على الضغط السلبي طوال التجربة.

< p class = "jove_title" >10. سحب Neurites

1. حدد حبة PDL متصلة بخلية عصبية في مجال الرؤية وقم بتثبيتها بالماصة الدقيقة الثانية باستخدام الشفط كما هو موضح في الخطوات 9.3-9.4.
2. اسحب مركب PDL-bead-neuron ببطء (~ 0.5 ميكرومتر / دقيقة) ، وحرك إما المعالج الدقيق أو مرحلة العينة بمقدار 1 ميكرومتر وتوقف مؤقتا لمدة 5 دقائق للسماح ببدء العصب.
3. كرر الخطوة 10.2 مرتين.
   ملاحظة: يجب سحب أول 3 ميكرومتر ببطء شديد لضمان النجاح التجريبي ، والذي يحدث أكثر من 95٪ من الوقت.
4. اسحب مركب PDL-bead-neuron عن طريق تحريك إما المعالج الدقيق أو مرحلة العينة بمقدار 2 ميكرومتر وتوقف مؤقتا لمدة 5 دقائق للسماح باستطالة العصب.
5. بعد البدء الناجح وتمديد العصبية لأول 5 ميكرومتر ، اسحب العصبية بسرعة 20 ميكرومتر / دقيقة على مسافات بمقياس ملليمتري.
   ملاحظة: يمكن إجراء السحب بشكل مستمر أو بخطوات وبمعدلات متفاوتة. انظر الشكل 6 ب - 6 ج.

< p class = "jove_title" >11. ربط الخلايا العصبية

1. حدد منطقة غنية بالخلايا العصبية وقم بخفض مركب PDL-bead-neurite بحيث يتصل به جسديا. استخدم حبات أخرى لقياس ارتفاع الطرف فوق سطح الغطاء. انظر الشكل 6 د.
2. اترك مركب PDL-bead-neurite ملامسا للعصبية المستهدفة أثناء معالجة الماصة الدقيقة الثانية. اخفض الماصة الثانية مع حبة PDL الثانية فوق العصبة المشكلة حديثا على بعد حوالي 20 ميكرومتر من الخرزة الأولى. استخدم حبة PDL الثانية لدفع خيوط العصبية الجديدة نحو الخلية المستهدفة.
3. ثبت كلا الخرزتين في مكانهما لمدة 1 ساعة على الأقل. تحقق من عدم وجود تورم بؤري ، سماكة الخلايا العصبية التي تلامس الخرزة ، باستخدام المجهر16.
4. خلال هذا الوقت ، استخدم التروية لتغيير وسط العينة ببطء من محلول ملحي فسيولوجي إلى NBM مسبق التسخين ، موازنة ثاني أكسيد الكربون.
5. حرر الخرزة من الماصة الثانية عن طريق تحرير الشفط. إذا ظل العصبة الجديدة متصلة ، فحرر الخرزة الأولى أيضا. انظر الشكل 6 ه.
6. قم بإزالة المحلول الملحي برفق واستبدله ب NBM (~ 2 مل).
7. ضع العينة بعناية مرة أخرى في الحاضنة لتقوية الاتصال العصبي للتجارب المستقبلية. هذا الاتصال مستقر ل >24

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: توحيد الثقافات العصبية باستخدام أجهزة الموائع الدقيقة 7. (أ) تجميع الجهاز: عندما يتم تجميع الأجهزة الموائع الدقيقة بشكل صحيح على سطح جاف ، تكون جميع الغرف مرئية. (ب) طلاء الخلية: قم بلوحة الخلايا الموجودة في أعلى البئر الأيمن ويجب أن تتحرك الخلايا نحو البئر الأيسر. (ج) كثافة الخلايا: بعد الطلاء مباشرة ، تحقق في المجهر إذا كان تركي...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الأجهزة العصبية أجهزة أناندا متوفر تجاريا في http:// www.anandadevices.com رقم 1 غطاء زجاجي 25 مم دائري وارنر إنسترومنتس 64-0705 طبق زراعة الخلايا 35 مم ، غير بيروجينيك ، معقم شركة كورنينج 430165 طبق بتري 95 مم × 15 مم ، غطاء قابل للانزلاق ، بوليسترين معقم فيشربراند FB0875714G الوسط العصبي القاعدي تقنيات الحياة هاتف: 21103-049 محلول خارج الخلية مكمل B-27 (50X) ، خال من المصل ثيرمو فيشر العلمي 17504044 محلول خارج الخلية بينيسيلين ، ستربتوميوسين، جلوتامين ثيرمو فيشر العلمي 11995-065 محلول خارج الخلية 2 - 20 ميكرولتر ماصات الهباء الجوي المقاومة للأطراف ثيرمو فيشر العلمي 2149 بكسل ملاقط دومون دوموستار 11 سم أدوات الدقة العالمية 500233 أدوات التشريح براون ، أسكولاب بولي دي ليسين هيدروبروميد سيجما ألدريتش ص 6407 الجسيمات الدقيقة القائمة على البوليسترين ، 10 ميكرومتر سيجما ألدريتش 72986 مجتذب الماصة الأفقي أدوات سوتر براون مشتعل P-97 معالجات دقيقة ، سلسلة PCS-5000 MC7600R أدوات SD MC7600R 1 مل حقنة BD لور لوك 309628 مجهر مقلوب أوليمبوس IX71 الهدف UIS2 أوليمبوس لوكبلن 40X كاميرا CCD القياسات الضوئية الشلال الثاني: 512