مقالة منهجية

توليد الخلايا العصبية عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية البشرية

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Shrigley، S.، et al. التوليد البسيط لثقافة عالية الغلة للخلايا العصبية المستحثة من الخلايا الليفية الجلدية البشرية البالغة. J. Vis. إكسب. (2018)

< p class = "jove_content" >يوضح الفيديو توليد الخلايا العصبية من الخلايا الليفية الجلدية البشرية البالغة (aHDFs). تتم إعادة برمجة aHDFs باستخدام ناقل فيروسي عدسي يحمل جينات لعوامل النسخ العصبي والحمض النووي الريبي القصير (shRNAs). تمنع shRNAs التعبير عن مثبط النسخ العصبي ، وتنشط عوامل النسخ العصبية الجينات لتمييز aHDFs إلى خلايا عصبية. يتم زراعة هذه aHDFs المعاد برمجتها في وسط تحويل الخلايا العصبية المبكر والمتأخر لتوليد الخلايا العصبية الناضجة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فئة

1. تحضير الخلايا الليفية الجلدية لإعادة البرمجة

  1. باستخدام نظام ذوبان الخلايا الآلي أو حمام مائي 37 درجة مئوية ، قم بإذابة الخلايا الليفية الجلدية البشرية البالغة (aHDFs) والصفيحة 200,000 لكل قارورة T75 (عد بعداد خلية آلي) في 10 مل من وسط الخلايا الليفية (انظر الجدول 1) عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  2. قم بإجراء تغيير متوسط كامل باستخدام وسط الخلايا الليفية في اليوم التالي.
  3. قم بتغيير وسط الخلايا الليفية كل 3-4 أيام حتى تصل الخلايا إلى 95٪ من التقاء.
    ملاحظه: ستحتوي قارورة واحدة ملتصقة على ما يقرب من 1،000،000 خلية.
< p class = "jove_title" >2. طلاء لإعادة البرمجة (اليوم −1) < p class = "jove_content" >ملاحظة: يوصى باستخدام طلاء الجيلاتين للتجارب قصيرة المدى (حتى 30 يوما) ؛ بدلا من ذلك ، بالنسبة للتجارب طويلة المدى ، يوصى بالبدء بطلاء بولي إل أورنيثين وفيبرونيكتين ولامينين (PFL).
  1. قبل 60 دقيقة من طلاء aHDFs لإعادة البرمجة ، قم بتغطية صفيحة 24 بئرا بنسبة 0.1٪ جيلاتين (250 ميكرولتر / بئر) واحتضانها عند 37 درجة مئوية.
  2. استنشاق وسط الخلايا الليفية على aHDFs. يغسل مرة واحدة بمحلول ملحي عازل للفوسفات (DPBS) من Dulbecco. قم بفصل الخلايا مع 0.05٪ تربسين (1.5 مل لكل قارورة T75) عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
  3. أضف وسط الخلايا الليفية لتحييد التربسين (3 مل لكل تدفق لكل قارورة T75) واجمع الخلايا المنفصلة في أنبوب سعة 15 مل عن طريق طرد الخلايا الموجودة في القارورة مرتين.
  4. قم بتدوير الخلايا عند 400 × جم لمدة 5 دقائق.
  5. عد الخلايا باستخدام عداد خلوي آلي (لضمان تحويل عالي الجودة ، تحقق من أن صلاحية الخلية أعلى من 90٪ مع تلطيخ التريبان الأزرق).
  6. للحصول على صفيحة كاملة مكونة من 24 بئرا ، قم بإعداد تعليق من 1،320،000 خلية في 13.2 مل من وسط الخلايا الليفية لتحقيق تعليق 100،000 خلية / مل من الوسط (أو 55،000 خلية / بئر في 550 ميكرولتر من وسط الخلايا الليفية مضروبا في عدد الآبار المطلوبة).
  7. استنشط الجيلاتين من الطبق واغسله مرتين باستخدام DPBS. أضف 500 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر واحتضنه طوال الليل عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
< p class = "jove_title" >3. التحويل الفيروسي (اليوم 0)

ملاحظة: يتطلب العمل مع جزيئات الفيروسات العدسية معدات من الفئة 2 واستخدام عامل لتحييد الفيروس. يوصى بشدة أيضا بارتداء أزواج مزدوجة من القفازات.

  1. قم بتسخين 13.2 مل من الخلايا الليفية المتوسطة إلى 37 درجة مئوية.
  2. قم بإذابة ناقل فيروسي عدسي يحتوي على عوامل النسخ achaete-scute family bHLH عامل النسخ 1 (Ascl1) و Brn2 مع اثنين من الحمض النووي الريبي القصير (shRNA) الذي يستهدف عامل النسخ الصافي RE1 (REST) في درجة حرارة الغرفة.
  3. أضف الحجم اللازم من فيروس العدسات لإصابة aHDFs عند تعدد العدوى (MOI) من 20 إلى الوسط دون أي معززات للتحويل.
    figure-protocol-1
  4. استبدل الوسط الموجود في الصفيحة المكونة من 24 بئرا بوسط الخلايا الليفية الذي يحتوي على ناقل الفيروس العسسي (500 ميكرولتر / بئر) واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  5. في اليوم التالي ، استبدل الوسط الموجود في الآبار بوسط الخلايا الليفية الطازجة بدون ناقل الفيروسات العسسية.
    ملاحظه: يعتبر الوسيط معديا لمدة 7 أيام ، وعلى هذا النحو ، يجب استخدام إجراءات الحماية والمناولة الكافية خلال الأسبوع الأول بعد نقل الفيروس.
< p class = "jove_title" >4. صيانة الخلايا المحولة

ملاحظة: بمجرد بدء التحويل ، تكون الخلايا عرضة للرفع ؛ احرص على قلب اللوحة لأعلى واستخدام ماصة 1,000 ميكرولتر عند إزالة الوسائط لتجنب انفصال الخلايا.

  1. في اليوم 3 ، قم بإزالة وسط الخلايا الليفية وأضف 500 ميكرولتر من وسط التحويل العصبي المبكر (انظر الجدول 1).
  2. مرتين إلى ثلاث مرات في الأسبوع ، أخرج 225 ميكرولتر من الوسط القديم من البئر وأضف 250 ميكرولتر من وسط التحويل العصبي المبكر الطازج.
  3. في اليوم 18 ، قم بإزالة كل الوسط من كل بئر واستبدله ب 500 ميكرولتر من وسط التحويل العصبي المتأخر (انظر الجدول 1).
  4. استمر في تغيير نصف الوسيط على النحو الوارد أعلاه باستخدام وسيط التحويل العصبي المتأخر كل 2-3 أيام حتى اليوم 25 أو نقطة نهاية التجربة (الشكل 1 أ).
< p class = "jove_content" > الجدول 1. تكوين الوسائط المختلفة المستخدمة. وصف كامل لتكوين الوسائط المطلوبة في هذا البروتوكول بما في ذلك وسط الخلايا الليفية ، ووسط التحويل العصبي المبكر ، ووسط التحويل العصبي المتأخر. تركيز المخزون تركيز العمل وسيط الخلايا الليفية متوسطة قاعدية غير متاح غير متاح البنسلين / الستربتومايسين 10,000 وحدة / مل 100 ملغم/مل FBS غير متاح 10٪ وسيط التحويل العصبي المبكر (ENM) وسيط التمايز العصبي غير متاح غير متاح البنسلين / الستربتومايسين 10,000 وحدة / مل 100 ملغم/مل CHIR99021 10 ملم 2 ميكرومتر SB-431542 20 ملم 10 ميكرومتر راس 100 ميكروغرام / مل 0.5 ميكروغرام / مل LDN-1931189 10 ملم 0.5 ميكرومتر VPA 1 م 1 ملي متر LM-22A4 20 ملم 2 ميكرومتر GDNF 20 ميكروغرام / مل 2 نانوغرام / مل NT3 10 ميكروغرام / مل 10 نانوغرام / ميكرولتر ديسيبل-cAMP 50 ملم 0.5 ملي وسط التحويل العصبي المتأخر (LNM) وسيط التمايز العصبي غير متاح غير متاح البنسلين / الستربتومايسين 10,000 وحدة / مل 100 ملغم/مل LM-22A4 20 ملم 2 ميكرومتر GDNF 20 ميكروغرام / مل 2 نانوغرام / مل NT3 10 ميكروغرام / مل 10 نانوغرام / ميكرولتر ديسيبل-cAMP 50 ملم 0.5 ملي

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: تطور تحويل iN بمرور الوقت.(أ) الجدول الزمني للتجربة وخريطة البناء المعبأة في فيروس عدسي يستخدم لإعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية البشرية البالغة. يمثل كل سهم أسود تغييرا متوسطا. (ب) صور تباين المرحلة التمثيلية التي تصور التغيرات في مورفولوجيا الخلايا أثناء عملية التحويل بين اليوم 0 إلى اليوم 22 (كما هو موضح في الزاوية اليمنى العليا من كل لوحة)....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خطوط الخلايا الخلايا الليفية الجلدية البشرية البالغة [ممر C2 # 7] كانت المتبرعة أنثى تبلغ من العمر 67 عاما. الخلايا التي تم الحصول عليها من أبحاث مرض باركنسون وعيادات مرض هنتنغتون في مركز جون فان جيست لإصلاح الدماغ (كامبريدج ، المملكة المتحدة). الكواشف لزراعة الخلايا الليفية ونقلها وتحويلها محلول ملحي Dulbecco المخزن بالفوسفات (DPBS) [-CaCl2 ، -MgCl2] جيبكو 14190094 التربسين EDTA [0.5٪] جيبكو 15400-054 خفف إلى 0.05٪ في DPBS. Virkon (عامل يستخدم لتحييد الفيروس) فيروديرم 7511 م خفف إلى محلول 1٪ بالماء الدافئ. مياه ميلي كيو ميليبور الوسط القاعدي - وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) + GlutaMax جيبكو 61965059 البنسلين / الستربتومايسين [10,000 وحدة / مل] جيبكو 15140-122 مصل الأبقار الجنينية (FBS) جيبكو 10270-106 ثنائي ميثيل سلفوكسيد CryoMACS® (DMSO) 10 ميلتيني 170-076-303 وسط التمايز العصبي - NDiff 227 تاكارا كلونتك Y40002 LM-22A4 توكرس 4607 تمييع 10 مجم في 1450 ميكرولتر DMSO.
تركيز المخزون: 20 ملم. عامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF) [إنسان مؤتلف] أنظمة البحث والتطوير 212-GD-010 تمييع 10 ميكروغرام في 500 ميكرولتر 0,1٪ BSA في DPBS. تركيز المخزون: 20 ميكروغرام / مل. NT3 [إنسان مؤتلف] أنظمة البحث والتطوير 267-N3-025 تمييع 25 ميكروغرام في 2,5 مل 0,1٪ BSA في DPBS. تركيز المخزون: 10 ميكروغرام / مل. ديسيبل-cAMP سيجما ألدريتش د0627 خفف 1 جم في 40,7 مل من الماء Milli-Q.
قم بتصفية وعمل 500 ميكرولتر أو أنابيب مخزون سعة 10 مل. تركيز المخزون: 50 ملم. CHIR99021 اكسون 1386 تمييع 2 ميكروغرام في 429,8 ميكرولتر DMSO.
تركيز المخزون: 10 ملم. LDN-193189 اكسون 1509 تمييع 2 مجم في 360 ميكرولتر DMSO.
تركيز المخزون: 10 ملم. ملح الصوديوم حمض الفالبرويك (VPA) ميرك ميليبور 676380 خفف 5 جم في ماء Milli-Q لتحقيق تركيز مخزون 1 متر. تنبيه: تجنب الابتلاع والتلامس مع الجلد وتكوين الغبار في التنفس. كواشف الطلاء الجيلاتين سيجما ألدريتش جي 2500 خفف إلى 0.1٪ في ماء Milli-Q. بولي إل أورنيثين سيجما ألدريتش ص 3655 تذوب في ماء Milli-Q. استخدم عند 15 ميكروغرام / مل. فيبرونيكتين ثيرموفيشر العلمي 33010-018 2 مل من ماء Milli-Q + 70 ميكرولتر 0,25 م هيدروكسيد الصوديوم. استخدم عند 5 ميكروغرام / مل. لامينين ثيرموفيشر العلمي 23017-015 يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية. قم بإذابة الثلج ، واحتفظ به باردا وتناول 30 ميكرولتر. معدات قارورة T75 [سطح دلتا نونكلين] ثيرموفيشر العلمي 156499 لوحة 24 بئر [Nunc] ثيرموفيشر العلمي 142485 1.5 مل أنبوب البولي بروبلين سيجما ألدريتش Z336769 أنبوب الصقر 15 مل سارستيدت 6,25,54,502 50 مل أنبوب الصقر سارستيدت 6,25,47,254 وحدة تحكم الماصة لأحجام سحب العينات 1-25 مل. الماصات المصلية المعقمة: 5 و 10 و 25 مل سارستيدت 86.1253.001 ، 86.1254.001 ، 86.1685.001 ماصات الحجم القابلة للتعديل: 5 و20 و200 و1,000 ميكرولتر أطراف ماصة معقمة لأحجام سحب العينة من 0.5 - 1,000 ميكرولتر. نظام ذوبان الخلايا الآلي ThawSTAR BioCision بي سي إس-601 عداد الخلايا الآلي للكونتيسة الثانية ثيرموفيشر العلمي AMQAX1000 غرف عد الخلايا [50 شريحة] وأزرق تريبان [0.4٪] ثيرموفيشر العلمي ج 10228 للاستخدام مع عداد الخلايا الآلي للكونتيسة الثانية. غطاء التدفق الصفحي حاضنة ترطيب 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 37 درجة مئوية الطرد المركزي مناسبة لأنابيب 1،5 و 15 و 50 مل. شاكر المداري مجهر مضان مقلوب لايكا DMI6000 ب

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

shRNA

مقالات ذات صلة