توليد والحفاظ على مزارع الشرائح من أنسجة الورم الأرومي الدبقي البشري

الملخص

المصدر: Parker, J.J., et al. نموذج لزراعة الشرائح العضوية للورم الأرومي الدبقي البشري لدراسة هجرة الخلايا السرطانية والتأثيرات الخاصة بالمريض للأدوية المضادة للتوغل. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح الفيديو توليد وصيانة مزارع الشرائح العضوية من أنسجة الورم الأرومي الدبقي. يتم تضمين الأنسجة المعزولة في مصفوفة الاغاروز ، ويتم الحصول على أقسام رقيقة باستخدام الاهتزاز. ثم يتم وضع هذه الأقسام على إدخالات غشائية قابلة للاختراق داخل صفيحة دقيقة ويتم زراعتها في وسائط صيانة ثقافة الشرائح للصيانة طويلة الأجل.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

1. التحضير المسبق للتقطيع

1. قم بإعداد وسائط "معالجة الأنسجة" و "صيانة ثقافة الشرائح" في اليوم السابق لاستئصال الورم المخطط له وجمع الأنسجة (أو استخدم الوسائط التي تم إنشاؤها مسبقا في غضون أسبوعين). أضف 5 مل من محلول البنسلين والستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) و 5 مل من 1 م 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض (HEPES) إلى 500 مل من وسط النسر المعدل عالي الجلوكوز (DMEM) لتوليد وسط معالجة الأنسجة.
2. قم بإعداد 250 مل من وسائط صيانة زراعة الشرائح باستخدام قاعدة من الوسط العصبي (على سبيل المثال ، Neurobasal) بدون أحمر الفينول. استكمل هذه الوسيلة ب 10 ملي مولار HEPES ، 1x مكمل B-27 ، 400 ميكرومتر L-glutamine ، 600 ميكرومتر L-alanyl-L-glutamine ثنائي الببتيد ، 60 U / مل بنسلين ، 60 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، و 6 U / مل نيستاتين.
3. قم بتخزين جميع الوسائط في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن أسبوعين.

فئة

2. يوم الجراحة: اكتساب الأنسجة

1. في يوم اكتساب الأنسجة ، قم بإعداد 50 - 100 مل من محاليل 1٪ و 2٪ (الوزن / الحجم) من أحلام درجة حرارة انصهار منخفضة في وسائط معالجة الأنسجة باستخدام الأواني الزجاجية المعقمة والتقنية المعقمة في غطاء التدفق الرقائقي. هناك حاجة إلى كلا تركيزي الاغاروز لاستيعاب التباين غير المتوقع في تناسق أنسجة الورم.
2. سخني معلق الاغاروز باستخدام الميكروويف حتى يلاحظ الغليان اللطيف. ضع محلول الاغاروز في حمام مائي 37 درجة مئوية للحفاظ عليه في حالة سائلة حتى الاستخدام.
3. ضع 1 مل من وسائط صيانة ثقافة الشرائح في كل بئر من لوحة 6 آبار.
4. استخدم ملقطا معقما لوضع إدخالات ثقافة بولي تترافلورو إيثيلين فارغة (PTFE) في كل بئر. ضع اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة والمغلفة بالماء مع جو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون₂ يتم الحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية.
5. باستخدام ماصة باستور معقمة في غطاء التدفق الرقائقي، قم بفقاعة خليط من 95٪ O₂/5٪ من غاز ثاني أكسيد الكربون في قارورة تحتوي على وسائط معالجة الأنسجة الباردة المثلجة لمدة 15 إلى 30 دقيقة تقريبا، قبل اكتساب أنسجة الورم. يقلل استخدام الوسائط فوق المؤكسجة من نقص الأكسجة في الأنسجة السائبة أثناء المعالجة.
6. قم بإعداد أنابيب مخروطية سعة 50 مل (تكفي للعدد المطلوب من مناطق الورم الفردية المراد عزلها) تحتوي على 20 مل من وسائط المعالجة المثلجة فوق المؤكسجة لنقل الأنسجة بين غرفة العمليات ومرفق التقطيع.
7. بالاشتراك مع جراح الأعصاب ، قم بتخطيط منطقة الورم قبل الجراحة للحصول على العينة. حدد منطقة الورم مع تحسين التباين كما هو موضح في التصوير السريري للمريض (تسلسل التصوير بالرنين المغناطيسي بعد الجادولينيوم T1). تشير التجربة السابقة إلى أن هذه المنطقة تنتج أنسجة ورمية قابلة للحياة بدلا من الأنسجة النخرية.
   ملاحظه: تمت محاولة توليد شرائح من المادة البيضاء المحيطة (حول الورم). ومع ذلك ، فإن التألق الذاتي في الخلفية وانخفاض كثافة الخلايا السرطانية يحد من الفائدة التجريبية لهذه الشرائح.
8. الحصول على أنسجة الورم في بداية استئصال الورم. تجنب تجمع أنسجة الورم المعرضة للكي ثنائي القطب الواسع النطاق ، مما قد يضر بصلاحية الأنسجة الثانوية للإصابة الحرارية. تظهر عينات الأنسجة التي تم الحصول عليها أثناء استئصال الورم بشكل مجزأ قابلية محسنة للحياة عند مقارنتها بالأنسجة المكتسبة من عمليات الاستئصال الطويلة في التكتل. قد تتعلق هذه الملاحظة بالحرمان التفاضلي من تدفق الدم في أنسجة الورم نتيجة الاستئصال الجراحي وتمديد الوقت للاكتساب.
9. إذا رغبت في ذلك، قم بوضع ملصقات وتخزين أنسجة الورم في أنابيب مخروطية منفصلة لعزل العينات من مناطق الورم المميزة. (أي الأنسجة السطحية مقابل الأنسجة الورمية العميقة). يمكن تسجيل مواقع الأنسجة الدقيقة إذا / عندما يكون التنقل الجراحي أثناء الجراحة متاحا.

< p class = "jove_title" >3. إعداد ثقافة الشريحة

1. ضع قطع أنسجة الورم في طبق بتري مع وسائط معالجة مثلجة. لغسل أنسجة الورم وتقليل خلايا الدم الحمراء الملتصقة ، استخدم ماصة لتبادل الوسائط برفق والتخلص منها في طبق بتري ثلاث مرات.
2. باستخدام مشرط ، قم بتقطيع قطع الورم إلى أشكال صندوقية مستطيلة. تقليم قطع المناديل إلى 3 مم × 3 مم × 10 مم تقريبا. قم بإزالة أي أوعية متصلة بعناية من خلال الاستئصال أو الجر اللطيف باستخدام ملقط دقيق.
3. الماصة 5 - 7 مل من 37 درجة مئوية الاغاروز في قالب تضمين بلاستيكي صغير على شكل مكعب (~ 2 سم³). تأكد من أن درجة حرارة محلول الاغاروز لا تزيد عن 37 درجة مئوية باستخدام مقياس حرارة معقم قبل الاستخدام.
4. دع الاغاروز يجلس لمدة 1 دقيقة تقريبا على سرير من الثلج.
5. ضع 2-4 "شرائح" من أنسجة الورم في الاغاروز بمحور طويل موجه عموديا. ملاحظه: تميل شرائط الأنسجة إلى "الغرق" في الاغاروز قبل التصلب. لتجنب هذه المضاعفات ، أمسك شريط الأنسجة مؤقتا في الاتجاه الرأسي حتى يتم ترسيخ الاغاروز بشكل أكبر.
6. احتفظ بالأنسجة التي تحتوي على عفن الاغاروز على طبقة من الثلج لمدة 2-5 دقائق لتسهيل التصلب.
7. قم بإزالة العفن من الجليد وإزالة كتلة الاغاروز برفق عن طريق قطع جوانب النموذج بمشرط. تجنب وضع القوة المفرطة على الكتلة ، مما قد يكسر الاغاروز.
8. استخدم قطرة كبيرة من غراء سيانواكريليت لتثبيت كتلة الاغاروز على لوحة عينة الاهتزاز. دع الغراء يثبت لمدة 1-2 دقيقة تقريبا.
9. املأ خزان الاهتزاز بوسائط معالجة مثلجة لغمر كتلة الاغاروز الملصقة على لوحة العينة.
10. أثناء التقطيع ، قم بفقاعة خليط غاز 95٪ O₂ / 5٪ CO₂ في خزان الاهتزاز من خلال ماصة بلاستيكية معقمة مشذبة.
11. اضبط سمك شريحة الاهتزاز على 300 - 350 ميكرومتر.
12. اضبط سرعة تقدم الشفرة وسعة الشفرة وفقا لتناسق الأنسجة. يتطلب نسيج الورم الأرومي الدبقي "الأكثر صلابة" سرعات تقدم أبطأ للشفرة وسعة أعلى. ستختلف إعدادات سرعة الشفرة والسعة الدقيقة وفقا لمواصفات الاهتزاز.
    ملاحظه: عادة ما تنشأ العديد من المشكلات أثناء التقطيع. إذا انفصل شريط الأنسجة من كتلة الاغاروز ، فحاول تضمين الأنسجة في أغاروز تركيز أعلى. إذا كانت شرائح الورم أكثر سمكا من المطلوب (مجموعة الماكينة) ، أو كانت غير متماثلة ، فقم بزيادة السعة وتقليل سرعة شفرة الاهتزاز. لضمان عدم التصاق الأنسجة الورمية أو "سحبها" بواسطة حامل الشفرة ، عند حدوث التقطيع ، ضع الملعقة الدقيقة بحذر بين حامل الشفرة والشريحة ، أثناء تحرك الشفرة.
13. انقل شرائح المناديل إلى طبق بتري باستخدام وسائط معالجة مثلجة باستخدام ملعقة دقيقة من الفولاذ المقاوم للصدأ.
14. احصل على ألواح ذات 6 آبار تحتوي على إدخالات PTFE ووسائط استزراع شرائح متوازنة من الحاضنة (كما هو محضر في القسم 2 ، الخطوة 4).
15. شرائح مناديل الألواح باستخدام ملعقة دقيقة من الفولاذ المقاوم للصدأ. قلل من التلامس المباشر والتلاعب بالأنسجة باستخدام فرشاة رسم صغيرة ذات شعيرات ناعمة لتوليد "موجة سائلة" لدفع الشريحة برفق من الملعقة إلى ملحق المزرعة.
    ملاحظه: قلل من كمية وسائط المعالجة التي يتم إدخالها أعلى ملحق مزرعة الأنسجة. إذا تم نقل كميات زائدة من الوسائط مما تسبب في طفو الشرائح، فاستخدم ماصة باستور معقمة لإزالة الوسائط.
16. أعد الألواح المكونة من 6 آبار التي تحتوي على شرائح الورم إلى حاضنة محفوظة عند 37 درجة مئوية مع غلاف جوي 5٪ من ثاني أكسيد الكربون₂.
    ملاحظه: يجب إكمال بروتوكول التضمين والتقطيع بالكامل في غضون 90 دقيقة من اكتساب أنسجة الورم من غرفة العمليات.

4. صيانة ثقافة الشريحة

1. بعد 12 - 24 ساعة ، انقل مزارع الشرائح عن طريق الإمساك بكل حافة إدخال بملقط معقم ، وانقلها إلى ألواح تحتوي على وسائط صيانة زراعة شرائح جديدة. تأكد من أن وسائط صيانة ثقافة الشرائح المقتبسة في كل بئر تتوازن في الحاضنة لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل نقل الإدخالات.
2. انقل الإدخالات إلى أطباق جديدة مكونة من 6 آبار مع وسائط ثقافة شرائح متوازنة جديدة كل 48 ساعة.
3. إذا رغبت في ذلك ، قم بتقطيع وسائط زراعة الشرائح القديمة بماصة للاستخدام الفوري في المقايسات الكيميائية الحيوية أو تجميدها عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMEM ارتفاع الجلوكوز [إنفيتروجن] ([جيبكو]) 11960-044 Neurobasal-A متوسط, ناقص الفينول الأحمر [إنفيتروجن] ([جيبكو]) هاتف: 12349-015 مكمل B-27 (50x) ، خال من المصل [إنفيتروجن] ([جيبكو]) 17504-044 البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) [إنفيتروجن] ([جيبكو]) 15140-122 مكمل GlutaMAX [إنفيتروجن] ([جيبكو]) 35050-061 L-جلوتامين (200 ملم) [إنفيتروجن] ([جيبكو]) هاتف: 25030-081 هيبس (1 م) [إنفيتروجن] ([جيبكو]) هاتف: 15630-080 تعليق النيستاتين سيجما ألدريتش N1638-20 مل 10,000 وحدة / مل في DPBS ، معالج معقم ، كاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلايا نقطة انصهار منخفضة فائقة النقاء أغاروز [إنفيتروجن] ([جيبكو]) 16520-050 يذوب عند 65.5 درجة مئوية ، ويظل سائلا عند 37 درجة مئوية ، ويستقر بسرعة أقل من 25 درجة مئوية. قالب تضمين Peel-A-Way (مربع - S22) Polysciences، Inc. 18646 أ -1 قوالب لتضمين عينة الورم ملاعق صغيرة من الفولاذ المقاوم للصدأ فيشر ساينتيك الطراز S50823 أداة الانحناء 45 درجة عند عنق شفرة الملعقة منحني Fisherbrand تشريح ملقط مدبب ناعم فيشر ساينتيك 08-875 شفرة حلاقة أحادية الحافة (ماكينات الحلاقة الأمريكية للسلامة) فيشر ساينتيك 17-989-001 حافة الشفرة بسمك 0.009 بوصة. تتم إزالة الغطاء ذو الحواف الحادة المجعد قبل التحميل على الاهتزاز. لايكا VT1000 S الاهتزاز لايكا بيوأنظمة VT1000 S إدراج ثقافة الخلايا PTFE المحبة للماء EMD ميليبور PICM0RG50 30 مم ، PTFE محب للماء ، حجم المسام 0.4 ميكرومتر أطباق قاع زجاجي مقاس 35 مم ماتيك P35G-1.5-20-C كم قطر الزجاج 20 مم. سمك زجاج الغطاء 1.5 مم حاضنة PECON Stagetop بيكون الألمانية (توقف) حاضنة PM 2000 RBT هو منتج قابل للفهم مصمم للاستخدام مع مجاهر زايس.