مقالة منهجية

تطوير نموذج زراعة الخلايا الثلاثية للحاجز الدموي الدماغي البشري

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Fattakhov ، N. ، et al. نموذج ثقافة الخلايا الأولية الثلاثية لحاجز الدم الدموي الدماغي البشري لدراسة السكتة الدماغية في المختبر. J. Vis. Exp.(2022)

يوضح هذا الفيديو الزراعة المشتركة للخلايا العضاقية والخلايا النجمية والخلايا البطانية في الدماغ البشري. يتم تشكيل كل طبقة خلية بشكل منفصل ثم يتم زراعتها معا ، مما يخلق نظاما من ثلاث طبقات يحاكي الترتيب الخلوي للحاجز الدموي الدماغي

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. إعداد نموذج BBB لثقافة الخلايا الثلاثية

  1. بذر الحبريات
    1. قم بزراعة HBVP (الخلايا العمومية الوعائية في الدماغ البشري) في قوارير ثقافة T75 ذات سطح منشط للتصاق الخلايا داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية حتى التقاء. بمجرد الوصول إلى التقاء ، استنشق وسط الحضاق القديم واغسل الخلايا ب 5 مل من محلول ملحي دافئ مخزن بالفوسفات (DPBS). استنشق DPBS وافصل الخلايا عن القارورة باستخدام مزيج من 4 مل من محلول التربسين-EDTA الدافئ و 1 مل من DPBS.
      ملاحظة: تجنب استخدام الممرات بعد P7.
    2. احتضان القارورة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2. انظر تحت المجهر للتأكد مما إذا كانت الخلايا منفصلة عن القارورة. أضف 5 مل من وسط الحمض الدافئ (يحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني [FBS]) إلى القارورة وانقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
    3. الطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 3 دقائق عند 200 × جم ، مما يسمح للخلايا بتكوين حبيبات في قاع الأنبوب. استنشق الوسط من الأنبوب, ضمان بقاء حبيبات الخلية سليمة.
    4. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط الحمض ؛ احسب كمية الوسط اعتمادا على التقاء الخلايا وعدد إدخالات البئر المطلوبة. خذ 10 ميكرولتر من الخلايا المعلقة ، وضعها في شريحة عد الخلايا ، واحسب عدد الخلايا.
    5. حدد كثافة الخلية وبذرة 300,000 خلية / إدراج في 1 مل من وسط الحمض على الجانب العظمي من إدراج البئر (تنسيق 6 آبار).
      ملاحظه: عند زرع HBVP على الجانب السفلي من الإدخالات ، من المهم قلب ألواح إدخال الآبار رأسا على عقب. أثناء وضع اللوحة بشكل مسطح على سطح ، قم بإزالة الجزء السفلي لفضح الجانب العظمي من إدراج البئر. قم بتغطية إدخالات البئر باللوحة المقلوبة بعد إضافة تعليق الخلية المحيطية على الجانب العظمي لمنع التبخر. حافظ على جميع الأطباق مقلوبة رأسا على عقب في حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
  2. بذر الخلايا النجمية
    1. قم بزراعة HA (الخلايا النجمية البشرية) في قوارير T75 داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية حتى يتم الوصول إلى التقاء. اتبع الخطوات المذكورة أعلاه 1.1.1-1.1.4 باستخدام وسط الخلايا النجمية (يحتوي أيضا على 2٪ FBS) بدلا من وسط السعي.
      ملاحظة: تجنب استخدام الممرات بعد P9.
    2. حدد كثافة الخلايا وبذر 300,000 خلية / بئر في قاع صفائح ثقافة الأنسجة المكونة من 6 آبار. قم بتغطية اللوحة لمنع التبخر واحتفظ بجميع الألواح في حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
  3. بذر الخلايا البطانية
    1. قم بزراعة HBMEC (الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري) في أطباق زراعة الأنسجة داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية حتى التقاء. اتبع الخطوات المذكورة أعلاه 1.1.1-1.1.4 باستخدام وسيط كلاسيكي كامل (يحتوي على 10٪ FBS) بدلا من وسط الحضيض.
      ملاحظه: تجنب استخدام الممرات بعد P12.
    2. أخرج زراعة الأنسجة ، وألواح 6 آبار تحتوي على الخلايا النجمية وإدخالات البئر (شكل 6 آبار) التي تحتوي على الحضيضات من حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. أضف 1 مل من وسط الحمض و 1 مل من وسط الخلايا النجمية لكل بئر.
    3. استنشق وسط الحمض من إدخالات البئر وضعه في صفائح ثقافة الأنسجة المكونة من 6 آبار تحتوي على الخلايا النجمية المصنفة. بذرة HBMEC بكثافة 300,000 خلية / بئر في 2 مل من الوسط الكلاسيكي الكامل على الجانب القمي من نفس إدراج البئر.
      ملاحظه: يجب زرع الخلايا البطانية على الجانب القمي من إدخالات البئر في اليوم التالي بعد بذر الخلايا المحيطة على الجانب العظمي من إدخالات البئر والخلايا النجمية على ألواح ثقافة الأنسجة المكونة من 6 آبار. يجب الحفاظ على الخلايا في مزرعة ثلاثية لمدة ستة أيام للحث على خصائص تشبه BBB. يجب تغيير وسط زراعة الخلية في كلا الحجرتين اللتين يتم إدخالهما جيدا قبل 24 ساعة من التجارب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 24 مم Transwell مع 0.4 ميكرومتر إدراج غشاء بوليستر مسامي كورنينج 3450 دولار أطباق قاع زجاجي مقاس 35 مم MatTek علوم الحياة (FISHERSCI) P35GC-1.5-14-C الخلايا النجمية المتوسطة خلية العلوم 1801 عامل التعلق أنظمة الخلية (فيشر العلمي) 4Z0-201 أكمل الوسيط الكلاسيكي مع المصل و CultureBoost 4Z0-500 أنظمة الخلايا أنابيب الطرد المركزي Corning 50 مل PP (قاع مخروطي مع غطاء CentriStar VWR 430829 كورنينج 75 سم² رقبة معلقة على شكل حرف U غير معالجة قارورة ثقافة الخلايا كورنينج 431464 وحدة Corning CellBIND 96 جيدا مسطحة شفافة القاع البوليسترين الأسود Microplates كورنينج 3340 ريال شرائح غرفة عد خلايا التهم ثيرمو فيشر العلمي ج 10228 عداد الخلايا الآلي للكونتيسة الثانية FL ثيرمو فيشر العلمي ZGEXSCCOUNTESS2FL DMEM متوسط (بدون جلوكوز ، بدون جلوتامين ، بدون فينول أحمر) ثيرموفيشر أ14430-01 وسط خال من الجلوكوز DPBS (بدون كالسيوم ، بدون مغنيسيوم) ثيرموفيشر 14190250 EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium، خال من الفينول بأحمر، 500 مل لونزا CC-3129 حاضنة CO2 الطرد المركزي

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

EDTA Dulbecco PBS

مقالات ذات صلة