مقالة منهجية

طريقة للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للخلايا النجمية القشرية الفأرية

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >المصدر: de Melo ، B. A. G. ، وآخرون ، الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للخلايا النجمية القشرية الفئران لهندسة الأنسجة الشبيهة بالأعصاب. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح الفيديو عملية إنشاء بنية ثلاثية الأبعاد مطبوعة حيويا باستخدام الخلايا النجمية المعلقة في محلول الحبر الحيوي. يسهل البناء المطبوع بيولوجيا ، بعد التشابك ، التصاق الخلايا النجمية وانتشارها ، وتشكيل أنسجة شبيهة بالأعصاب.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تخليق الجيلاتين ميثاكريلويل (GelMA)

  1. يزن 10 جم من الجيلاتين الذي يتم الحصول عليه من جلد الخنازير ويذوب في 100 مل من PBS عن طريق ترك المحلول يقلب على لوح تسخين عند 240 دورة في الدقيقة و 50 درجة مئوية حتى الذوبان الكامل.
  2. تحت غطاء المحرك ، أضف 2 مل من أنهيدريد الميثاكريليك (MA) للحصول على درجة منخفضة من الوظيفية ، واترك مستحلب الجيلاتين يتحرك عند 240 دورة في الدقيقة و 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة < / > أنذر: بيان خطر MA: H302 + H332 (ضار عند الابتلاع أو الاستنشاق) ، H311 (سام عند ملامسته للجلد) ، 314 (يسبب حروقا شديدة في الجلد وتلف العين) ، 315 (يسبب تهيج الجلد) ، H317 (قد يسبب رد فعل تحسسي للجلد) ، H318 (يسبب تلفا خطيرا في العين) ، 331 (سام إذا تم استنشاقه) ، H332 (ضار إذا تم استنشاقه) ، H335 (قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي). إرشادات المناولة: P261 (تجنب استنشاق الغبار / الدخان / الغاز / الضباب / الأبخرة / الرذاذ) ، P305 + P351 + P338 + P310 (في حالة وجود العينين: اشطفها بحذر بالماء لعدة دقائق. قم بإزالة العدسات اللاصقة ، إذا كانت موجودة وسهلة التنفيذ. استمر في الشطف. اتصل على الفور بمركز السموم / الطبيب) ، P301 + P312 + P330 (إذا كان الغمر: اتصل بمركز السموم / الطبيب إذا شعرت بتوعك. اشطف الفم).
    ملاحظه: أضف المتوسط المتحرك ببطء شديد ، قطرة قطرة.
  3. قم بتخفيف محلول الجيلاتين-MA في 100 مل من PBS المسخن مسبقا (50 درجة مئوية) للحصول على 200 مل من الحجم النهائي واترك المحلول يتحرك عند 240 دورة في الدقيقة و 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. قطع ~ 20 سم من غشاء غسيل الكلى (قطع جزيئي 12-14 كيلو دالتون) وانقعه في ماء منزوع الأيونات حتى يصبح طريا.
    ملاحظه: املأ الأغشية بالماء منزوع الأيونات لضمان عدم وجود ثقوب أو عيوب.
  5. باستخدام قمع ، انقل محلول الجيلاتين-MA إلى الأغشية.
    ملاحظه: أغلق كلا الجانبين مع ترك مساحة إضافية بالداخل للسماح بالخليط.
  6. ضع الأغشية التي تحتوي على محلول الجيلاتين-MA في وعاء به 2 لتر من الماء المقطر لغسيل الكلى ، واتركها تقلب عند 40 درجة مئوية لمدة 5 أيام (500 دورة في الدقيقة).
    ملاحظه: قم بتغطية الحاوية لتجنب تبخر الماء.
  7. قم بتغيير الماء المقطر مرتين في اليوم. في كل مرة ، اقلب الأغشية رأسا على عقب للتجانس.
  8. في اليوم الخامس، اخلطي 200 مل من الماء عالي النقاء المسخن مسبقا (40 درجة مئوية) مع الجيلاتين MA المحال للغسيل وقلبي لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
  9. انقل محلول الجيلاتين-MA إلى 50 مل من الأنابيب المخروطية حتى 25 مل واترك الأنابيب تبقى عند -80 درجة مئوية لمدة يومين.
    ملاحظه: قم بتخزين الأنابيب أفقيا لتسهيل التجميد.
  10. قم بتجميد المحاليل المجمدة لمدة 3-5 أيام وقم بتخزين GelMA المجفف بالتجميد محميا من الرطوبة.
< p class = "jove_title" >2. تحضير Bioink

ملاحظة: من أجل الحصول على 1 مل من الحبر الحيوي ، يوصى بتصنيع ما لا يقل عن 3 مل من محلول المواد الحيوية ، حيث قد تكون هناك خسائر أثناء الترشيح.

  1. تحضير محلول الفيبرينوجين
    1. تحضير محلول ملحي (كلوريد الصوديوم 0.9٪) في ماء منزوع الأيونات ، وإذابة 10 مجم من الفيبرينوجين من بلازما الأبقار في 1 مل من المحلول الملحي للحصول على تركيز 10 مجم / مل < br / > ملاحظه: عندما يمتص الفيبرينوجين الزجاج ، لا تستخدم قوارير زجاجية لتحضير محلول الفيبرينوجين.
    2. اترك المحلول تحت التحريك عند 37 درجة مئوية حتى الذوبان الكامل للفيبرينوجين.
      ملاحظة: لإذابة الفيبرينوجين ، استخدم نظاما دواريا يوضع داخل فرن عند 37 درجة مئوية. في ظل هذه الحالة ، يستغرق 10 مجم / مل من الفيبرينوجين حوالي 40 دقيقة ليذوب.
  2. تحضير محلول الجيلاتين / GelMA
    1. قم بوزن 0.12 جم من الجيلاتين وأضفه إلى 1.9 مل من PBS المسخن مسبقا (40 درجة مئوية) للحصول على تركيز نهائي قدره 4٪ (وزن / حجم) الجيلاتين. دوامة لتسهيل الذوبان.
    2. احتفظ بالمستحلب عند 40 درجة مئوية حتى الذوبان الكامل.
    3. قم بوزن 0.06 جم من GelMA المجفف بالتجميد وانقله إلى محلول الجيلاتين للحصول على تركيز نهائي قدره 2٪ (وزن / حجم) GelMA. دوامة لتسهيل الذوبان.
    4. احتفظ بالمحلول عند 40 درجة مئوية حتى الذوبان الكامل.
< p class = "jove_title" >3. تحضير الجيلاتين المحمل بالخلايا النجمية / GelMA / الحبر الحيوي الفيبرينوجين

  1. ماصة 0.9 مل من محلول الفيبرينوجين 10 ملغم/مل ونقلها إلى محلول الجيلاتين/جيلماس للحصول على تركيز نهائي قدره 3 ملغم/مل من الفيبرينوجين.
  2. يزن 0.015 جم من البادئ الضوئي (PI) وينقل إلى محلول الجيلاتين / GelMA / الفيبرينوجين للحصول على تركيز نهائي قدره 0.5٪ (وزن / حجم) PI. امزج المحلول عن طريق قلب الأنبوب لأعلى ولأسفل واحتفظ به عند 40 درجة مئوية محميا من الضوء لتجنب تدهور PI.
    ملاحظه: قم بتخزين الحبر الحيوي عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة كحد أقصى.
  3. تحت التدفق الصفحي ، قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل.
    ملاحظه: يجب أن يكون محلول المواد الحيوية عند 37-40 درجة مئوية للسماح بالترشيح.
  4. نقل 980 ميكرولتر من محلول المواد الحيوية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
  5. تمييع اللامينين في محلول ملحي للحصول على محلول مخزون 100 ميكروغرام / مل.
  6. ماصة 20 ميكرولتر من اللامينين ونقلها إلى الأنبوب الذي يحتوي على الحبر الحيوي للحصول على تركيز نهائي يبلغ 2 ميكروغرام / مل لامينين.
  7. امزج برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ، وتجنب الفقاعات. إذا استمرت أي فقاعات ، فقم بالطرد المركزي للأنبوب المخروطي عند 200 × جم لمدة دقيقتين. احتفظ بالحبر الحيوي عند 37 درجة مئوية حتى يختلط بالخلايا.
  8. قم بترشيح الخلايا النجمية الأولية مع 0.05٪ من التربسين لمدة 5 دقائق < / > ملاحظه: استخدم الخلايا النجمية من الممرات من 1 إلى 3.
  9. قم بتحييد نشاط التربسين باستخدام FBS بنسبة 1: 1 ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
  10. عد الخلايا وانقل 1 × 106 خلايا إلى أنبوب مخروطي مختلف. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
  11. قم بإزالة المادة الطافية تاركة حجما صغيرا (~ 200 ميكرولتر) لتعليق حبيبات الخلية ، عن طريق النقر برفق على قاع الأنبوب المخروطي.
  12. انقل 1 مل من محلول الجيلاتين / GelMA / الفيبرينوجين إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا وقم بالماصة برفق لأعلى ولأسفل حتى تتجانس ، والحصول على تركيز نهائي يبلغ 1 × 106 خلايا / مل.
< p class = "jove_title" >3. تحضير محلول الربط المتقاطع

  1. إعادة تشكيل الثرومبين
    1. تحضير محلول مخزون من الثرومبين 100 وحدة / مل في ماء معقم منزوع الأيونات مع 0.1٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل البقر (BSA) في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. مخزون في الأنابيب الدقيقة عند -20 درجة مئوية
      ملاحظة: عندما يمتص الثرومبين الزجاج ، لا تستخدم قوارير زجاجية لتحضير محلول المرق أو تخزين الحصص الصغيرة.
  2. تحضير محلول الثرومبين-CaCl2
    1. ماصة 100 ميكرولتر من محلول مخزون الثرومبين ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 8.9 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات للحصول على تركيز نهائي يبلغ 1 وحدة / مل من الثرومبين.
    2. قم بإعداد محلول CaCl2 بنسبة 10٪ (وزن / حجم) في ماء منزوع الأيونات وتعقيمه باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر.
    3. انقل 1.1 مل من محلول CaCl2 بنسبة 10٪ إلى الأنبوب المخروطي المحتوي على الثرومبين من أجل الحصول على نسبة نهائية تبلغ 1: 9 (CaCl2 إلى الثرومبين).
      ملاحظه: قم بإعداد محلول الربط المتقاطع في وحدة التخزين للتجربة ، وتجنب التخزين.

4. الطباعة الحيوية للحبر الحيوي المحمل بالخلايا النجمية باستخدام طابعة حيوية قائمة على البثق

  1. تصميم الأنسجة العصبية
    1. باستخدام الرمز G: قم ببناء شبكة مقاس 6 × 6 مم (شكل مربع) مع مسافة 1 مم بين كل خط مطبوع حيويا على المحور X و Y ، و 6 طبقات على المحور Z (0.2 مم بين كل سطر) ؛ اضبط البثق (E) على 0.01 مم ، وزيادة 0.001 مم عند كل طبقة جديدة من المحور Z ؛ واضبط سرعة الطباعة (F) على 400 مم / دقيقة (معلومات تكميلية).
  2. إعداد الطابعة الحيوية
    1. قم بتعريض الجهاز للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة ، ثم امسحه بالإيثانول بنسبة 70٪.
    2. قم بتشغيل الطابعة الحيوية باستخدام مفتاح الطاقة. قم بتوصيل الجهاز بالكمبيوتر من خلال كابل USB. افتح برنامج التحكم لتوصيله بالطابعة الحيوية وقم بتحميل تصميم الملف.
  3. تحضير حقنة الطباعة الحيوية
    1. انقل الحبر الحيوي الجيلاتين/GelMA/الفيبرينوجين المحمل بالخلايا النجمية إلى حقنة بلاستيكية سعة 5 مل باستخدام ماصة سعة 1,000 ميكرولتر.
      ملاحظه: انقله ببطء لتجنب تكوين الفقاعات.
    2. قم بتوصيل إبرة غير حادة معقمة 22 جم بالمحقنة.
      ملاحظه: اترك المحقنة على حرارة 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين.
    3. قم بتوصيل المحقنة برأس طباعة الطابعة الحيوية وقم بمسح الحبر الحيوي يدويا لإزالة الفقاعات المتبقية.
  4. الطباعة الحيوية
    ملاحظة:     تم إجراء الطباعة الحيوية خارج غطاء المحرك الرقائقي.
    1. ضع طبق استزراع مقاس 35 مم على طاولة الطابعة الحيوية وضع الإبرة على بعد 0.1 مم من سطح طبق المزرعة للسماح بحركة الإبرة.
      ملاحظة: استخدم طبق استزراع واحد مقاس 35 مم لكل طباعة حيوية.
    2. اضغط على زر طباعة.
    3. بمجرد انتهاء الطباعة الحيوية ، تأكد من أن المحقنة تتحرك بعيدا عن الطبق. بعد ذلك ، أغلق طبق الثقافة واستعد لعملية الربط المتقاطع.
      ملاحظه: تستغرق الطباعة الحيوية لبناء واحد حوالي 1 دقيقة و 10 ثوان.
  5. الربط بين البناء المطبوع بيولوجيا والثقافة
    1. ضع طبق الثقافة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية عند 2 ميجاواط / سم 2 لمدة 2 × 60 ثانية (لأعلى ولأسفل) للتشابك GelMA.
    2. تحت التدفق الصفحي ، انقل الهيكل المطبوع بيولوجيا إلى صفيحة مكونة من 24 بئرا باستخدام ملعقة معقمة.
    3. أضف 500 ميكرولتر من محلول الثرومبين / CaCl2 واتركه لمدة 30 دقيقة للسماح بالتشابك بين الفيبرين.
    4. قم بإزالة محلول التشابك واغسل البناء ب 2 مل من PBS 1x. بعد ذلك ، استبدل PBS ب 1 مل من وسط زراعة الخلايا النجمية واحتضانه عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. قم بتغيير الوسيط كل 3 أيام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات طابعة حيوية ثلاثية الأبعاد حلول التكنولوجيا الحيوية ثلاثية الأبعاد طابعة حيوية قائمة على البثق ملقط حاد إنتيجرا ميلتكس 6--30 ملقط لتشريح الدماغ تم تعقيمه مسبقا ألبومين مصل الأبقار سيجما ألدريتش 9048-46-8 خال من البروتياز وخالي من الأحماض الدهنية وخالي من الغلوبيولين بشكل أساسي CaCl2 سيجما ألدريتش هاتف: 10043-52-4 قارورة زراعة الخلية فيشر ساينتيك هاتف: 156340 قارورة ثقافة T25 دابي أبكام أب224589 محلول تلطيخ DAPI DMEM / F12 جيبكو. شركة لايف تكنولوجيز 12500062 DMEM / F-12 50/50 ، 1X (Dulbecco's Mod. من Eagle's Medium / Ham's F12 50/50 Mix) مع L-glutamine أنابيب Dyalisis سيجما ألدريتش د9527 قطع الوزن الجزيئي = 14 كيلو دالتون ايثانول فيشر ساينتيك 64-15-5 درجة الكاشف مصل الأبقار الجنينية جيبكو. شركة لايف تكنولوجيز 12657011 درجة البحث الفيبرينوجين سيجما ألدريتش 9001-32-5 مسحوق الفيبرينوجين البلوري من بلازما الأبقار الجيلاتين سيجما ألدريتش 9000-70-8 مسحوق الجيلاتين من جلد الخنازير محلول الملح المخزن في هانكس (HBSS) جيبكو. شركة لايف تكنولوجيز 14175095 خال من الكالسيوم ولا المغنيسيوم ولا أحمر الفينول لامينين سيجما ألدريتش هاتف: 114956-81-9 Laminin 1-2 مجم / مل لتر في 50 ملي Tris-HCl أنهيدريد الميثاكريليك سيجما ألدريتش 760-93-0 لتحضير GelMA إبرة 22 جرام فيشر ساينتيك NC1362045 إبرة حادة معقمة طبق بتري كورنينج إنكوربوريتد 430591 ، 430588 أطباق بتري معقمة 35 و 100 مم البادئ الضوئي سيجما ألدريتش هاتف: 106797-53-9 2-هيدروكسي -4 ′ - (2-هيدروكسي إيثوكسي) -2-ميثيل بروبيوفينون محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) جيبكو. شركة لايف تكنولوجيز 10010023 PBS 1 x ، درجة الثقافة ، بدون كالسيوم ، بدون مغنيسيوم بولي إل ليسين سيجما ألدريتش هاتف: 25988-63-0 بولي إل ليسين هيدروبروميد مول بالوزن 30،000-70،000 حقنة 5 مل دينار بحريني 1222 ج 84 حقنة معقمة مرشح الحقنة 2 ميكرومتر فيشر ساينتيك 09-740-105 فلتر البولي بروبلين للتعقيم الثرومبين سيجما ألدريتش 9002--04-4 مسحوق الثرومبين كريستالين من بلازما البقر تريتون X-100 سيجما ألدريتش 9002-93-1 درجة المختبر التربسين EDTA جيبكو. شركة لايف تكنولوجيز 15400054 التربسين لا الفينول الأحمر 1 × مخفف في PBS لوحة البئر الترمو: العلمية هاتف: 144530 لوحة معقمة 24 بئر

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة