هيدروجيل قائم على حمض الهيالورونيك لزراعة خلايا الورم الأرومي الدبقي ثلاثية الأبعاد

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Xiao ، W. ، et al. هيدروجيليات قائمة على حمض الهيالورونيك لثقافة ثلاثية الأبعاد لخلايا الورم الأرومي الدبقي المشتقة من المريض. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو كيف يتم فصل الغلاف الدبقي ، المشتق من أورام المخ ، إلى خلايا مفردة وتغليفها في هيدروجيل قائم على حمض الهيالورونيك. تعزز هذه العملية تفاعلات الخلية والخلية ، وتشكل نموذجا منظما ثلاثي الأبعاد للورم الأرومي الدبقي.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. ثيولاسیون حمض الهيالورونيك

ملاحظة: يتم ذكر النسب المولية فيما يتعلق بالعدد الإجمالي لمجموعات الكربوكسيل ما لم ينص على خلاف ذلك.

1. قم بإذابة 500 مجم من هيالورونات الصوديوم (HA ، 500-750 كيلو دالتون) عند 10 مجم / مل في الماء المقطر منزوع الأيونات (DiH₂O) في قارورة أوتوكلاف معقمة 250 مل من Erlenmeyer. حرك المحلول (~ 200 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين لإذابة HA بالكامل. استخدم قضيب التحريك ولوحة التحريك المغناطيسية للحفاظ على تفاعل الفعل أثناء إجراء الثيول.
2. باستخدام حمض الهيدروكلوريك 0.1 M (HCl) ، اضبط الرقم الهيدروجيني لمحلول HA إلى 5.5. وزن 69.6 مجم (نسبة مولية 0.25x) من 1-إيثيل -3- (3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) كاربوديميد (EDC).
   ملاحظه: على الرغم من أنه يمكن إضافة EDC غير المذاب مباشرة إلى محلول HA ، إلا أنه من الأسهل عادة إذابة EDC أولا في 1 مل من DiH₂O ثم إضافة محلول EDC بسرعة إلى محلول HA. يمكن أيضا إجراء ما قبل الذوبان في 1 مل من DiH₂O باستخدام N-hydroxysuccinimide (NHS) و cystamine dihydrocholoride قبل إضافته إلى التفاعل في الخطوتين 1.3 و 1.4.
3. أضف 17.9 مجم (نسبة مولارية 0.125x) من NHS إلى التفاعل. اضبط الرقم الهيدروجيني لمحلول التفاعل على 5.5 باستخدام 0.1 M HCl واحتضان التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
4. أضف 70.0 مجم (نسبة مولارية 0.25x) من ثنائي هيدروكلوريد السيستامين في محلول التفاعل. استخدم 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.25. احتضان التفاعل في درجة حرارة الغرفة طوال الليل أثناء التحريك.
5. في اليوم التالي ، استخدم 1 M هيدروكسيد الصوديوم لضبط الرقم الهيدروجيني لمحلول التفاعل إلى حوالي 8. أضف 192 مجم (نسبة مولارية 4x) من ثنائي ثيوثريتول (DTT) إلى التفاعل. اضبط الرقم الهيدروجيني مرة أخرى إلى 8 بعد إضافة DTT واتركه مع التحريك لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
6. استخدم 1 م حمض الهيدروكلوريك لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 4. انقل خليط التفاعل بالكامل إلى غشاء غسيل الكلى المنقوع مسبقا (قطع الوزن الجزيئي حوالي 13 كيلو دالتون) وغسيل الكلى مقابل DiH₂O المعدل مسبقا إلى درجة الحموضة 4.
   ملاحظه: يجب أن يكون حجم DiH₂O لغسيل الكلى 40 ضعف حجم محلول HA المتفاعل (على سبيل المثال ، عينة 50 مل في 2 لتر من DiH₂O ، درجة الحموضة 4).
7. استبدل محلول غسيل الكلى (DiH₂O ، درجة الحموضة 4) مرتين يوميا لمدة 3 أيام في درجة حرارة الغرفة.
8. قم بتصفية المحلول الممحلول من خلال غشاء 0.22 ميكرومتر ، مرشح يعمل بالفراغ. محلول التجميد السريع من HA الثيولي في النيتروجين السائل. استخدم مجفف التجميد لتجميد العينات الجافة على مدى يومين. يمكن تخزين حمض الهيالورونيك الثيولي في شكل جاف في مجفف محكم الغلق عند -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل.
9. لتحديد درجة الثيول، استخدم اختبار إلمان و/أو التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي للبروتون.
    

< p class = "jove_title" >2. تحضير مواد التشابك

1. قم بإذابة حمض الهيالورونيك المثلث بالتركيز المطلوب (في هذا المثال ، 13.3 مجم / مل) في محلول ملحي مخزن ب HEPES (20 ملي مولار HEPES في محلول ملحي متوازن من هانك (HBSS) ، تم تعديله ليقع ضمن درجة حموضة 8-9) في قارورة كهرمانية لتقليل التعرض للضوء المحيط. حافظ على المحلول مع التحريك باستمرار.
   ملاحظه: قد يحدث تكوين روابط ثاني كبريتيد بين الثيول المترافقة مع HA إذا كان الرقم الهيدروجيني أعلى من 8 ، أو كان تركيز المحلول مرتفعا جدا ، أو ترك المحلول مقليبا لفترة طويلة قبل الهلام. لتجنب هذه المشكلة ، استخدم أقل من 15 مجم / مل من حمض الهيالورونيك الثيولي وقم بإذابة حمض الهيالورونيك الثيولي في غضون ساعتين من تكوين الهلاميات المائية.
2. قم بإذابة 4 أذرع PEG-maleimide (PEG-Mal ، 20 كيلو دالتون) و 4 أذرع PEG-thiol (PEG-thiol ، 20 كيلو دالتون) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4 ، لتحضير 50 مجم / مل من محاليل مخزون PEG-Mal و PEG-thiol.
   ملاحظه: يستغرق الأمر ساعة واحدة على الأقل لإذابة كواشف PEG بالكامل.
3. في حالة إضافة الببتيدات المشتقة من ECM ، قم بإذابة الببتيدات المحتوية على السيستين في PBS لتحضير محلول مخزون.
   ملاحظه: استخدم تركيز مخزون 2-4 مليمتر.
4. انقع قوالب مطاط السيليكون في الإيثانول لمدة 20 دقيقة على الأقل لتنظيفها ثم قم بتعقيمها للتعقيم.

فئة

3. تشابك الهيدروجيل وتغليف الخلايا

< p class = "jove_content" >ملاحظة: كمثال هنا ، يتم وصف تغليف أربعة هلاميات هيدروجينية فردية ، 80 ميكرولتر مع 0.5٪ (وزن / حجم) HA ومعامل ضغط 1 كيلو باسكال 3. يرجى الاطلاع على الجدول 1 ، على سبيل المثال ، الوصفات التي تنتج هيدروجيلات ذات خصائص متفاوتة: اثنان من الهلاميات المائية التي تشتمل على الببتيد المرتبط بالإنتجرين RGD واثنين من الهلاميات المائية التي تشتمل على أغطية السيستين كتحكم سلبي لنشاط الببتيد. تركيز البذر لخلايا GBM المشتقة من المريض هو 500,000 خلية / مل.

1. يخفف محلول مخزون PEG-Mal (50 ملغم/مل، من الخطوة 2.2) إلى 12.5 ملغم/مل بإضافة 40 ميكرولتر من محلول المخزون إلى 120 ميكرولتر من المخزون PBS. قسم المحلول المخفف إلى أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل ، يحتوي كل منهما على 80 ميكرولتر.
2. أضف 16 ميكرولتر من محلول RGD (2.8 ملي مولار ، من الخطوة 2.3) إلى أنبوب واحد و 16 ميكرولتر من محلول السيستين (2.8 ملي مولار ، من الخطوة 2.3) إلى الأنبوب الثاني. دوامة للخلط. ضع محاليل PEG-Mal-RGD أو PEG-Mal-CYS على الثلج حتى الاستخدام في الخطوة 3.9.
   ملاحظه: ينتج عن الإجراء كما هو موضح هنا الهلاميات المائية التي تحتوي على ~ 140 ميكرومتر من الببتيد. هذا يعادل ما يقرب من 1 من كل 8 أذرع PEG متاحة مشغولة بالببتيد. يمكن أن يختلف هذا عن طريق تغيير النسبة المولية للببتيدات المنتهية بالسيستين إلى مجموعات الماليميد المتاحة. بشكل عام ، يمكن تحقيق تركيز أقصى يبلغ 280 ميكرومتر من الببتيد مع ترك أعداد كافية من مجموعات الماليميد المتاحة للتشابك الهيدروجيل.
3. قم بتخفيف محلول مخزون PEG-thiol (50 ملغم/مل، من الخطوة 2.2) إلى 5 ملغم/مل عن طريق خلط 4 ميكرولتر من محلول مخزون 50 ملغم/مل مع 36 ميكرولتر من PBS. أضف 120 ميكرولتر من حمض الهيالورونيك المذاب والمثلث من الخطوة 2.1 إلى الخليط.
   ملاحظه: حلول HMW HA لزجة للغاية. وبالتالي، نوصي باستخدام طرف ماصة دقيقة ذات فتحة عريضة لنقل المحاليل. الماصة ببطء لتجنب التصاق المحلول بجدران طرف الماصة الدقيقة ولتحسين دقة القياس.
4. ضع القوالب النظيفة والجافة (المحضرة في الخطوة 2.4) في كل بئر من لوح 12 بئرا غير معالج بزراعة الأنسجة. باستخدام الطرف النظيف وغير الحاد لطرف الماصة ، اضغط على قالب الجل وتحقق جيدا من الختم بين القوالب والجزء السفلي من لوحة البئر.
   ملاحظه: افحص الختم مرة أخرى قبل التغليف مباشرة لمنع التسرب.
5. ممر خلايا GBM المزروعة ، وينفصل عن الخلايا المفردة ويحدد تركيز الخلية كما هو موضح سابقا3.
   ملاحظه: لا يمكن فصل بعض خطوط GBM إلى خلايا مفردة. في هذه الحالة ، يمكن تغليف الغلاف الدبقي الكامل. ومع ذلك ، قم بإعداد خلايا مفردة منفصلة بعد عد الخلايا بدقة لتحسين قابلية التكاثر. يختلف بروتوكول مرور الغلاف الدبقي بين المختبرات المختلفة ومن المحتمل أن يكون العديد منها متوافقا مع تغليف الهيدروجيل.
   1. (موصى به) الغلاف الدبقي للطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 1 مل من إنزيم تفكك الخلية إلى حبيبات الخلية. ثم احتضن لمدة 5 دقائق ، مع النقر برفق على الأنبوب للتحريك.
   2. أضف 4 مل من وسط المزرعة الكامل (50 نانوغرام / مل EGF ، 20 نانوغرام / مل FGF-2 ، 25 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، مكمل G21 ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين في DMEM / F12) إلى الخلايا.
   3. جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 500 × جم لمدة 5 دقائق وإزالة المادة الطافية. أخيرا ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من الوسط الكامل وقم بتمرير الخلايا العالقة عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر. (موصى به) اغسل المصفاة ب 4 مل إضافية من الوسط الكامل لزيادة عدد الخلايا المستردة.
6. تقدير تركيز الخلايا في المعلق باستخدام مقياس كثافة الدم. تقسيم تعليق الخلية إلى 2 أنابيب الطرد المركزي ، حيث يحتوي كل أنبوب على ~ 80,000 خلية. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ؛ بشكل عام ، ستشكل 80.000 خلية 2 80 ميكرولتر من الهلاميات المائية.
7. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات واحدة في 80 ميكرولتر من محلول PEG-MAL-RGD وحبيبات ثانية في 80 ميكرولتر من محلول PEG-MAL-CYS (محضر في الخطوة 3.1).
8. باستخدام طرف ماصة دقيقة ذات فتحة عريضة سعة 200 ميكرولتر، قم بتوزيع 40 ميكرولتر من محلول HA (من الخطوة 3.3 أعلاه) في كل قالب سيليكون مطاطي (كما هو موضح في الخطوة 3.4).
9. باستخدام طرف ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر ذات فتحة عريضة، امزج 40 ميكرولتر من محلول خلية PEG-MAL-CYS أو PEG-MAL-RGD مع محلول HA في القالب. الماصة لأعلى ولأسفل بسرعة لا تزيد عن 10 مرات. كرر لكل مزرعة هلامية يتم تحضيرها.
   ملاحظه: تتطلب هذه الخطوة ممارسة ، حيث يحدث التبلور الأولي بسرعة (في غضون 30 ثانية). الماصة لأعلى ولأسفل أثناء تحريك الطرف إلى مواقع مختلفة في القوالب لضمان الخلط المتساوي. احتفظ دائما بالحافة تحت مستوى السائل لتجنب تكون فقاعات الهواء. لا تخلط المحلول عدة مرات حيث قد يتكون الجل داخل طرف الماصة الدقيقة. يمكن الجمع بين PEG-MAL-CYS و PEG-MAL-RGD بنسب متفاوتة لتحقيق تركيز ببتيد RGD المطلوب.
10. ضع الصفيحة الجيدة التي تحتوي على خلايا مغلفة بالهلام في حاضنة زراعة خلايا 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق لضمان اكتمال التفاعل.
11. أضف 2-2.5 مل من وسط الثقافة إلى كل بئر مع المواد الهلامية المكونة. استخدم طرف ماصة معقم سعة 2 ميكرولتر أو ملعقة دقيقة لفصل القالب والهلام برفق. استخدم ملقطا معقما مسبقا لإزالة القالب من لوحة البئر. ضع لوحة البئر مرة أخرى في حاضنة الخلية (37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) للثقافة والتجارب المستقبلية.
    ملاحظه: اسحب القالب عموديا لأعلى لتجنب الإضرار بمزارع الجل. بشكل عام ، يجب استبدال الوسط في مزارع الهلام كل 3-4 أيام. احرص على عدم شفط الهلاميات المائية عند إزالة الوسط. إذا كانت هذه مشكلة ، فإننا نوصي باستخدام ماصة نقل البلاستيك. إذا تم التخطيط للتصوير الحيوي لتتبع عدد الخلية ، فيجب تحويل خلايا GBM مع فيروس العدسات الذي يشفر تعبير لوسيفيراز بشكل أساسي قبل التغليف ، كما هو موضح سابقا3. للتصوير الحيوي ، أضف 1 ملي مولار من D-luciferin إلى وسط المزرعة قبل ساعة واحدة من التصوير المضيء.

النتائج

< p class = "jove_content" > الجدول 1. تركيبات هيدروجيل تنتج تحكما مستقلا في تركيز HA والخصائص الميكانيكية.

نوع الجل الجزء أ (40 ميكرولتر لكل منهما) الجزء ب (40 ميكرولتر لكل منهما) 4Arm-PEG-MAL (50 مجم / مل) السيستين أو ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مقياس الأس الهيدروجيني ثيرمو فيشر غير متاح أي مقياس الأس الهيدروجيني الذي يحتوي على حساسية الأس الهيدروجيني 2-10 طبق التحريك ثيرمو فيشر غير متاح معدات المختبرات العامة قارورة إرلينماير (125 مل) ثيرمو فيشر الفيسبوك -501-125 دورق بولي بروبلين سعة 2 لتر ثيرمو فيشر S01916 هيالورونان الصوديوم لايف كور HA700k-5 نطاق 500-750 كيلو دالتون 1-إيثيل -3- (3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) كاربوديميد (EDC) ثيرمو فيشر بي -22980 N-hydroxysuccinimide (NHS) سيجما ألدريتش هاتف 130672-5 جيجا حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك ) ثيرمو فيشر SA48-500 هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) ثيرمو فيشر SS266-1 سيستامين ثنائي هيدروكلوريد ثيرمو فيشر AC111770250 ديثيولثريتول (DTT) ثيرمو فيشر بي ت 172-25 كاشف اختبار إلمان (5- (3-كربوكسي -4-نيتروفينيل) حمض ثنائي سولفانيل -2-نيتروبنزويك سيجما ألدريتش D218200-1 جرام الماء المنزوع (أكسيد الديوتيريوم) ثيرمو فيشر AC166301000 0.22 ميكرومتر مرشح مدفوع بالفراغ سيلتريت 229706 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثيرمو فيشر P32080-100T ملح هانكس المتوازن (HBSS) ثيرمو فيشر MT-21-022-السيرة الذاتية 4 ذراع PEG-ماليميد تقنية JenKem أ 7029-1 الوزن الجزيئي حوالي 20 كيلو دالتون 4 ذراع PEG-ثيول تقنية JenKem أ 7039-1 الوزن الجزيئي حوالي 20 كيلو دالتون L-سيستين سيجما ألدريتش C7880-100G RGD ECM الببتيد المقلد Genscript Biotech غير متاح الببتيد المخصص مع تسلسل "GCGYGRGDSPG" ، يجب أن يكون N الطرفية أسيتيل قوالب السيليكون سيجما ألدريتش GBL664201-25 إيه استخدم شفرة الحلاقة لتقطيعها إلى قطع مفردة وسط ثقافة كامل مختلف مختلف DMEM / F12 (Thermofisher) مع مكمل غير مصلي (G21 من GeminiBio) ، عامل نمو البشرة 50 نانوغرام / مل (Peprotech) ، عامل نمو الخلايا الليفية 20 نانوغرام / مل (Pepro Tech) والهيبرين 25 ميكروغرام / مل (Sigma Aldrich) ، يختلف وسط الاستزراع في المختبرات المختلفة خلية GBM المشتقة من المريض غير متاح غير متاح قرص صغير مثبط البروتياز / الفوسفاتيز سيجما ألدريتش 5892970001 تريب إل إكسبريس ثيرمو فيشر 12604013 مصفاة خلية 70 ميكرومتر ثيرمو فيشر 22-363-548 حاضنة زراعة الخلايا ثيرمو فيشر غير متاح أي عام واحد مع 5٪ CO2 و 37C ثلاجة / فريزر ثيرمو فيشر غير متاح أي معدات مختبر عام بسعة -20 درجة مئوية و -80 درجة مئوية قوالب التضمين التي يمكن التخلص منها ثيرمو فيشر 12-20 أطراف ماصة فتحة عريضة ثيرمو فيشر 9405120