تحليل بقاء خلايا بركنجي في مزارع شرائح المخيخ العضوية

الملخص

المصدر: Rakotomamonjy, J., et al. بقاء خلية بركنجي في مزارع شرائح المخيخ العضوية. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو تقنية للحصول على شرائح عضوية مخيخية من دماغ جرو الفأر وزراعة الشرائح في وسائط مكملة بالعناصر الغذائية وعوامل النمو لتقليد نمو المخيخ في المختبر. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التعامل مع شرائح مخيخية معينة بمركب اختبار ، ويتم تحليل قدرة الحماية العصبية للمركب باستخدام تقنية تلطيخ التألق المناعي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. التحضير قبل زراعة شرائح المخيخ

العضوية

1. في غطاء مزرعة الخلية الذي تم رشه بنسبة 70٪ من الإيثانول مسبقا ، قم بإعداد 200 مل من وسط المزرعة في مرشح تفريغ أعلى زجاجة سعة 250 مل متصل بجهاز استقبال زجاجة معقم. أضف 100 مل من النسر القاعدي المتوسط (BME) ، و 50 مل من محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) ، و 50 مل من مصل الحصان المعطل بالحرارة ، و 1 مل من 200 مل من L-Glutamine (التركيز النهائي 1 مل) ، و 5 مل من 200 جم / لتر من الجلوكوز (التركيز النهائي 5 مجم / مل). قم بتصفية وسط الاستزراع بالمكنسة الكهربائية واحتفظ به عند +4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر.
2. في خزانة السلامة الحيوية المعقمة ، أخرج لوحة ثقافة مكونة من 6 آبار من عبوتها. املأ كل بئر ب 1 مل من وسط الاستزراع. إذا تم اختبار العلاج ، أضف العامل الدوائي إلى البئر المعالج ، ونفس الحجم من محلول السيارة لبئر التحكم. في هذه الدراسة ، أضفنا 1 ميكرولتر من محلول 3 M KCl المعقم إلى البئر المعالج (30 ملي مولار نهائي) و 1 ميكرولتر من الماء المعقم إلى آبار التحكم.
3. أحضر داخل غطاء مزرعة الخلية العدد المطلوب من إدخالات زراعة الخلايا الملفوفة بشكل فردي مع غشاء بولي تترافلورو إيثيلين محب للماء (PTFE) (حجم المسام = 0.4 ميكرومتر). قم بفكها بعناية وأخرج إدخالات ثقافة الخلايا باستخدام ملقط معقم. قم بإسقاطها واحدة تلو الأخرى في بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار ، وتجنب الفقاعات في الواجهة بين غشاء الإدخال ووسط زراعة الخلية. دع الإدخالات تتوازن في الوسط في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة ساعتين على الأقل قبل الزراعة.
   ملاحظه: توجد مروحية الأنسجة بشكل دائم في غطاء مزرعة الخلايا.
4. قم بإعداد كوبين سعة 200 مل ، أحدهما مملوء ب 150 مل من الماء المعقم ، والآخر مملوء ب 150 مل 70٪ إيثانول. اغمس الأدوات الجراحية في حمام الإيثانول بنسبة 70٪ ثم في الماء قبل استخدامها.
   ملاحظه: لا تستخدم الأدوات الجراحية مباشرة بعد ملامسة الإيثانول.
5. قم بتطهير الشفرة ذات الحدين في دورق الإيثانول بنسبة 70٪. ضعه على حامل الشفرة باستخدام ملقط معقم وثبته في مكانه باستخدام مفتاح ربط الشفرة. اتركه يجف حتى الاستخدام.
6. قم بتطهير القرص البلاستيكي المرفق مع مفرمة المناديل في دورق الإيثانول بنسبة 70٪. رش طاولة التقطيع بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل وضع القرص عليها. اتركه يجف حتى الاستخدام.

< p class = "jove_title" >2. تشريح وثقافات الشرائح العضوية المخيخية

1. أحضر جرو الفأر داخل غطاء مزرعة الخلية لإجراء التشريح.
2. اقطع رأس الجرو بسرعة باستخدام مقص التشغيل المستقيم (الشكل 1 أ).
3. أثناء إمساك رأس الجرو من الأنف باستخدام ملقط ضماد مستقيم ، افتح فروة الرأس باستخدام مقص العين المستقيم ، بدءا من الطرف الخلفي ، والانتقال إلى خط الوسط.
4. تابع بشكل مماثل للجمجمة.
   ملاحظه: تأكد من توجيه أطراف المقص للخارج لتجنب إتلاف المخيخ أثناء التشريح.
5. أخرج الدماغ وانقله إلى طبق 60 مم مليء ب HBSS البارد + 5 مجم / مل من الجلوكوز.
6. قم بتشريح المخيخ بعناية باستخدام ملقط دقيق مستقيم معقم (الشكل 1 ب). انقله إلى القرص البلاستيكي الموجود على طاولة التقطيع الخاصة بمفرمة المناديل باستخدام ملقط دقيق منحني معقم.
7. قم بتوجيه الأنسجة عن طريق تدوير طاولة القطع لأداء المقاطع الطفيلية.
8. حرك طاولة القطع عن طريق سحب مقبض تحرير الطاولة إلى اليمين ، بحيث يتم وضع الشفرة على حافة الأنسجة.
9. اضبط سمك الشريحة على 350 ميكرومتر وسرعة الشفرة إلى متوسطة.
10. ابدأ المروحية. بمجرد تقطيع المخيخ بالكامل (الشكل 1 ج) ، قم بإيقاف تشغيل المروحية.
11. قم بإزالة القرص البلاستيكي باستخدام ملقط معقم.
12. قم بإحضار القرص البلاستيكي بحذر بالقرب من طبق 60 مم يحتوي على HBSS + 5 مجم / مل من الجلوكوز. ماصة HBSS باردة + 5 ملغم / مل من الجلوكوز على الأنسجة باستخدام ماصة نقل معقمة للسماح بحصاد شرائح المخيخ في الطبق المملوء بالمخزن المؤقت.
13. افصل شرائح المخيخ عن بعضها البعض باستخدام مسبار دقيق. أخرج أقساما عالية الجودة باستخدام ماصة النقل (يوصى باستخدام أقسام الأنسجة القريبة من الدودة) وقم بإسقاطها في ملحق مزرعة خلية متوازن مسبقا (الشكل 1 د).
14. ضع شرائح المخيخ على ملحق مزرعة الخلية باستخدام المسبار المجهري ، ثم قم بإزالة محلول الجلوكوز HBSS + 5 مجم / مل الزائد بعناية باستخدام ماصة النقل.
    ملاحظه: في هذه المرحلة ، تكون الأنسجة رقيقة للغاية وعرضة للتلف الجسدي. يعتمد الحد الأقصى لعدد شرائح المخيخ لكل إدراج مزرعة خلية على عمر المتبرع. يمكن استزراع 6-8 شرائح لحيوان قديم P0-P4 ، و 4-6 شرائح للحيوانات التي يزيد عمرها عن P5.
15. ضع طبق الثقافة في الحاضنة ، وقم بتغيير الوسط تماما كل 2-3 أيام.
16. لتقييم بقاء خلايا بركنجي ، يمكن جمع الشرائح في وقت مبكر يصل إلى 5 أيام في المختبر. لأغراض أخرى ، يمكن الاحتفاظ بها في الثقافة لعدة أسابيع (الشكل 1F).
    ملاحظه: في حالة تجارب بقاء خلايا بركنجي ، ليست هناك حاجة لتجديد العلاج الدوائي عند تغيير وسط زراعة الخلايا (الشكل 1F).

< p class = "jove_title" >3. التألق المناعي

1. أخرج الطبق المكون من 6 آبار من الحاضنة. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا ، واغسل إدراج ثقافة الخلية باستخدام 1x PBS ، وقم بإصلاح الشرائح بمحلول بارافورمالدهيد بارد بنسبة 4٪ لمدة ساعة واحدة ، مع 1 مل تحت إدراج ثقافة الخلية و 500 ميكرولتر أعلى إدراج ثقافة الخلية.
2. اغسل الإدخالات 4 × 10 دقائق باستخدام 1x PBS ، مع 1 مل أقل و 500 ميكرولتر أعلى الملحق ، على شاكر مداري.
3. باستخدام فرشاة ، انقل شرائح المخيخ من إدراج مزرعة خلية واحدة إلى بئر واحد من 24 بئرا مملوءة مسبقا ب 1x PBS و 0.25٪ Triton X-100 و 3٪ BSA (PBS-TB) ، 500 ميكرولتر / بئر.
4. تخلل الشرائح وسدها عن طريق الحضانة في PBS-TB لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
5. احتضان الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول PBS-TB، طوال الليل عند + 4 درجات مئوية، على شاكر مداري 200 ميكرولتر/بئر.
6. في اليوم التالي ، قم بإجراء أربع غسلات لمدة 10 دقائق باستخدام 1x PBS ، على شاكر مداري ، 500 ميكرولتر / بئر.
7. احتضان الأجسام المضادة الثانوية المخففة في محلول PBS-TB، لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة، على شاكر مداري ومحمي من الضوء، 200 ميكرولتر/بئر.
8. قم بإجراء أربع غسلات لمدة 10 دقائق باستخدام 1x PBS ، على شاكر مداري ، 500 ميكرولتر / بئر.
9. قم بتلطيخ الشرائح باستخدام Hoechst 33342 ، المخفف في 1x PBS (2 ميكروغرام / مل) ، لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، محمي من الضوء ، 500 ميكرولتر / بئر.
10. قم بتركيب شرائح المخيخ على شريحة مجهرية باستخدام ماصة نقل. دعهم يجففون تماما في الهواء ، محميين من الضوء. أعد ترطيبها باستخدام 1x PBS وقم بتطبيق غطاء مغطى ببضع قطرات من وسط التثبيت (~ 80 ميكرولتر). تجنب صنع أي فقاعات.
11. بمجرد أن يعالج وسط التركيب ، تكون الأقسام المخيخية جاهزة للتصوير.

< p class = "jove_title" >4. التصوير والقياس الكمي لبقاء الخلية

1. قم بتشغيل المجهر والليزر وفقا للشركة المصنعة.
2. ابدأ برنامج الاستحواذ.
3. باستخدام هدف 10X ، حدد موقع شرائح المخيخ غير المتغيرة التي تحتوي على 9-10 فصيصات (عادة ما تكون أقسام مخيخية قريبة من الدودة).
4. تنشيط اكتساب z-stack. حدد نطاق z-stack ليشمل جميع خلايا بركنجي الموجودة في شريحة المخيخ. قم بتعيين حجم خطوة 2 ميكرومتر وابدأ الاستحواذ. احفظ الصورة المكتسبة بتنسيق الشركة المصنعة لبرنامج الاستحواذ للحفاظ على بيانات التعريف المرتبطة بها.
5. افتح الملف الذي تم الحصول عليه في ImageJ باستخدام المكون الإضافي Bio-formats.
6. انتقل إلى Image > Stacks > Z-project... (الشكل 2 أ).
7. اختر Max Intensity في القائمة المنسدلة نوع الإسقاط وانقر فوق OK (الشكل 2B).
8. سيتم إنشاء صورة ثنائية الأبعاد مسطحة. انقر نقرا مزدوجا فوق أداة النقاط المتعددة للسماح بظهور نافذة أداة النقطة. قم بإلغاء تحديد خيار نقاط التسمية لتسهيل تصور الخلايا التي تم عدها. ثم انقر مباشرة على سوما خلية بركنجي لبدء العد (الشكل 1E). سيشار إلى العدد الإجمالي للخلايا التي تم عدها في أسفل نافذة أداة النقاط (الشكل 3).
   ملاحظه: عادة ، يمكن تحديد ما لا يقل عن 3 أقسام غير تالفة تحتوي على 9-10 فصيصات لكل إدراج مزرعة خلية. لتقييم التأثير الوقائي العصبي لعامل دوائي ، يجب إجراء 3 تجارب مستقلة على الأقل.

النتائج

الشكل 1: رسم توضيحي للبروتوكول من التشريح إلى القياس الكمي لبقاء خلية بركنجي. يتم قطع رأس جرو الفأر بسرعة (أ). بعد تشريح الدماغ ، يتم عزل المخيخ (B) ، ثم يتم تقطيعه إلى شرائح بعرض 350 ميكرومتر (C). توضع الأقسام المخيخية على إدراج مزرعة الخلايا المعالج أو الضابط (D) ويتم الاحتفاظ بها في المزرعة لمدة 5 أيام على الأقل في المختبر. ثم يتم...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Alexa Fluor 594 الحمار المضاد للفأر IgG الجسم المضاد الثانوي ثيرموفيشر العلمي أ 21203 النسر القاعدي المتوسط (BME) ثيرموفيشر العلمي 21010046 خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانية ، النوع A2 نوير NU-540-400 ألبومين مصل الأبقار ميليبور سيجما أ 2153 فرش الجسم المضاد المضاد للكالبندين D-28K (CB-955) أبكام أب82812 حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ نوير NU-5700 لوحات ثقافة الخلايا المسطحة من Corning Costar ذات 6 آبار فيشر ساينتيك 07-200-83 أغطية ، 22 × 50 مم فيشر ساينتيك 12-545-ه ملقط خلع الملابس ، مستقيم جهاز هارفارد 72-8949 شفرات مزدوجة الحواف فيشر ساينتيك 50949411 دليل الإيثانول 200 مختبرات ديكون ، وشركة 2701 مقص العين ، مستقيم جهاز هارفارد 72-8428 ملقط ناعم فيشر ساينتيك 16-100-127 L-جلوتامين 100X ثيرموفيشر العلمي 25030149 محلول الجلوكوز ثيرموفيشر العلمي A2494001 محلول الملح المتوازن من هانكس ثيرموفيشر العلمي 14025092 Hoechst 33342 ، ثلاثي هيدروكلوريد ، ثلاثي الهيدرات فيشر ساينتيك H21492 مصل الحصان ، معطل بالحرارة ، من أصل نيوزيلندي ثيرموفيشر العلمي 26050088 إيمج جيه ماكلوين مروحية مناديل فيشر ساينتيك NC9914528 المجسات الدقيقة فيشر ساينتيك 08-850 إدراج ثقافة الخلايا Millicell ميليبور سيجما PICM0RG50 وحدات التصفية المعقمة سريعة التدفق من Nalgene مع غشاء PES ، 250 مل ثيرموفيشر العلمي 168-0045 نظام مجهر ليزر متحد البؤر من نيكون A1R نيكون برنامج التصوير NIS-Elements نيكون بارافورمالدهيد أكروس أورجانكس هاتف: 41678-0010 ماصات باستور فيشر ساينتيك 13-678-20 د كلوريد البوتاسيوم فيشر ساينتيك BP366-500 ProLong Gold Antifade Mountant ثيرموفيشر العلمي ص10144 مقص التشغيل ، مستقيم جهاز هارفارد 72-8403 شاكر المداري الراقصة الشرقية IBI Scientific BDRLS0003 المنشور 8 لوحة الرسم البياني شرائح مجهر Superfrost Plus فيشر ساينتيك 12-550-15 طبق زراعة الأنسجة، 60 مم مع حلقة قبضة فيشر ساينتيك FB012921 صفيحة زراعة الأنسجة ، 24 بئر فالكون / كورنينج 353047 نقل الماصات المعقمة ثيرموفيشر العلمي 13-711-21 تريتون X-100 ثيرموفيشر العلمي بي بي 151-500