فصل واستزراع الخلايا العصبية من عينات أنسجة الحصين

الملخص

المصدر: Servello، D. et al. ، نظام ميكانيكي ميكروبيولوجي لدراسة تكوين الدوالي والتعافي في محاور الخلايا العصبية المركزية. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو تفكك وثقافة الخلايا العصبية في الحصين من عينات أنسجة الحصين باستخدام التفكك الأنزيمي والميكانيكي. يمنع العلاج باستخدام Ara-C نمو الخلايا غير العصبية ، مما يسهل النمو الانتقائي للخلايا العصبية في الحصين.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

فئة

1. تشريح وتفكك وثقافة الخلايا العصبية في الحصين من الفأر / الفئران الحامل

1. تشريح وتفكك الخلايا العصبية في الحصين للثقافة
   1. قم بإذابة محلول إنزيم البروتياز (3 مجم / مل من البروتياز 23 في محلول تشريح الشريحة ، SLDS ، الجدول 1) ووسائط الطلاء الدافئة مسبقا (الجدول 2) عند 37 درجة مئوية.
   2. تشريح الحصين وشطفه باستخدام SLDS.
      ملاحظه: توفر أربعة حصين خلايا كافية لصفيحة واحدة مكونة من 24 بئر أو 6 آبار.
   3. قم بإزالة SLDS ، وأضف 2 مل من محلول إنزيم البروتياز ، واحتضن العينة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} ، لمدة 15 دقيقة.
   4. اغسل نباتات الحصين ب 5-10 مل من وسط الطلاء مرتين. أضف 5 مل من وسط الطلاء. قم بفصل مستخلصات الحصين إلى خلايا مفردة عن طريق توليد دوامة صغيرة باستخدام ماصة ذات طرف بلاستيكي سعة 1 مل. الماصة لأعلى ولأسفل حوالي 40 مرة ، وتجنب تكوين فقاعات الأكسجين ، حتى يصبح المحلول غائما ولا تبقى قطع كبيرة من النثرة.
      ملاحظه: تذكر أن تترك بعض الوسائط أثناء الغسيل ، يجب أن تظل نباتات الحصين مغمورة في الوسط أثناء العملية برمتها.
   5. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 1,125 × جم لمدة 3 دقائق. أعد تعليق الخلايا في 145 مل من وسائط الطلاء. أضف 1 مل / بئر من تعليق الخلية إلى صفيحة 24 بئرا (3 مل / بئر إلى صفيحة 6 آبار). < / > ملاحظة: يتم استخدام 145 مل من وسائط الطلاء لإنتاج معلق خلوي ذو كثافة خلوية منخفضة. سيسمح هذا الحجم بطلاء الخلايا في ستة ألواح مكونة من 24 بئرا ، أو ثماني ألواح مكونة من 6 آبار ، أو مجموعات مختلفة من ألواح 24 أو 6 آبار ، اعتمادا على التجارب التي سيتم إجراؤها. سيحتوي كل بئر من الصفيحة المكونة من 24 بئرا على حوالي 3 × 10⁴ خلايا.
   6. احتضان الخلايا في وسائط الطلاء عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 2-4 ساعات ، ثم قم بإزالة جميع وسائط الطلاء واستبدلها بوسائط صيانة جديدة.
   7. بعد يومين (يومان في المختبر ، 2DIV) ، استبدل نصف الوسائط ب 2 ميكرومتر Ara-C (أرابينوسيل سيتوزين) مذابة في وسط الصيانة ، مما يمنع نمو الخلايا الليفية والخلايا البطانية والدبقية. بعد تعريض الخلايا ل Ara-C لمدة يومين ، استبدل الوسائط بوسائط صيانة جديدة.

< p class = "jove_content" > الجدول 1: محلول طلاء الغطاء. يوفر وصفة لتحضير محلول طلاء الغطاء المستخدم للصق الخلايا المستنبتة على الغطاء.

محلول طلاء Coverslip 780 ميكرولتر حمض الخليك 17 مليونمن المخزون: 50 ميكرولتر من حمض الأسيتيك في 50 مل من H₂O 200 ميكرولتر بولي د-ليسين (مخزون 0.5 ملغ/مل) 20 ميكرولتر كولاجين ذيل الجرذ (3 مجم / مل من المرقة) يتم تحديد الحجم الإجمالي بناء على عدد الأغلفة المراد تغطيتها. < p class = "jove_content" > الجدول 2: وصفات وسائط زراعة الخلايا. يوفر وصفات لإعداد الوسائط المستخدمة في زراعة الخلايا العصبية الأولية في الحصين.

1x محلول تشريح الشريحة (SLDS) ، مفلتر ، درجة الحموضة = 7.4 ، يخزن في 4 درجات مئوية 1 لتر ddH₂O 82 مللي نا₂سو₄ 30 ملم ك₂سو₄ 10 ملم HEPES (حمض خال) 10 ملم د-الجلوكوز 5 مللي متر مغنكلوريد₂ 0.00٪ الفينول الأحمر (اختياري) وسائط الطلاء (PM ، مرشح ، تخزين عند 4 درجات مئوية) 439 مل أملاح MEM إيرل 50 مل FBS 11.25 مل 20٪ د-جلوكوز 5 مل بيروفات الصوديوم (100 مليمتر) 62.5 ميكرولتر L-جلوتامين (200 ملم) 5 مل البنسلين / الستربتومايسين (P / S ، 100x) وسائط الصيانة (مم ، مرشح ، تخزين عند 4 درجات مئوية) 484 مل العصبي العصبي 10 مل مكمل B27 50x 1.25 مل L-جلوتامين (200 ملم) 5 مل 100x P / S يتم تعقيم جميع المحاليل باستخدام مرشح بحجم مسام 0.2 مم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أغطية 12 مم وارنر إنسترومنتس 64-0702 لطبق 24 بئر أغطية 25 مم فيشر ساينتيك 12-545-102 لطبق 6 آبار حمض الخليك فيشر ساينتيك أ 38-212 بولي دي ليسين سيغما ص 6407 كولاجين ذيل الفئران روش 11 179 179 001 10X PBS التشخيص الوطني CL-253 Na2SO4 فيشر ساينتيك S373-500 ك 2SO4 فيشر ساينتيك ص 304-500 هيبس فيشر ساينتيك BP410-500 د-الجلوكوز فيشر ساينتيك د16-500 كلوريد المغنيسيوم 2 فيشر ساينتيك بي ت 214-500 هيدروكسيد الصوديوميوم فيشر ساينتيك SS255-1 إنزيم البروتياز سيغما ص 4032 FBS جيبكو هاتف: 26140 بيروفات الصوديوم جيبكو هاتف: 11360-070 ل-جلوتامين جيبكو 25030081 البنسلين / الستربتومايسين 100x (P / S) جيبكو 15140122 أملاح MEM إيرل جيبكو هاتف 11090 مكمل B27 جيبكو 17504-044 العصبي العصبي جيبكو هاتف: 21103-049 أرابينوزيل سيتوزين (Ara-C) سيغما 147-94-4 وسائط Opti-MEM جيبكو 31985-070