مقالة منهجية

تمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية إلى خلايا قليلة التغصن

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Assetta, B., et al. جيل من الخلايا العصبية البشرية والخلايا قليلة التغصن من الخلايا الجذعية متعددة القدرات لنمذجة تفاعلات الخلايا العصبية قليلة التغصن. J. Vis. إكسب (2020).

يوضح هذا الفيديو عملية توليد الخلايا السليفة قليلة التغصن (OPCs) من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، متبوعة بنضج OPCs إلى الخلايا قليلة التغصن. تفتح عملية توليد الخلايا قليلة التغصن طرقا عديدة لتحسين البحث والعلاج للأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك مرض الزهايمر.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تحريض الخلية السليفة البشرية قليلة التغصن (OPC) من الخلايا الجذعية متعددة القدرات ونضوج الخلايا قليلة التغصن

  1. توليد الخلية السلفية العصبية (NPC): بروتوكول أحادي الطبقة (~ 7 أيام). انظر الشكل 1 أ للحصول على مخطط التدفق.
    1. استخدم خلايا الجذع الجنينية البشرية H1 المتوفرة تجاريا عند مرور 52 (انظر جدول المواد). استزراع الخلايا على ألواح 6 آبار مطلية بمحلول مصفوفة خارج الخلية (~ 0.5 مجم من محلول المصفوفة لكل صفيحة ذات 6 آبار ؛ انظر جدول المواد) باستخدام وسيط صيانة الخلايا ES (انظر جدول المواد) واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    2. قم بتحويل الخلايا إلى خلايا سلفية عصبية (NPCs) من خلال نهج راسخ يسمى SMADi المزدوج ، مع مثبطات جزيئات صغيرة لمسارات إشارات متعددة. هنا نستخدم مجموعة تجارية مقبولة على نطاق واسع ونتبع بروتوكول أحادي الطبقة الذي توفره الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    3. في اليوم -1 ، لوحة 0.5-1 × 106 خلايا لكل بئر في صفيحة من 6 آبار مغلفة بمحلول مصفوفة مخفضة لعامل النمو (انظر جدول المواد ؛ ~ 0.5 مجم من محلول المصفوفة لكل صفيحة مكونة من 6 آبار) مع وسط صيانة الخلايا الجذعية الجنينية (ES) (انظر جدول المواد). يستخدم محلول المصفوفة المخفض لعامل النمو هذا لتغطية جميع الألواح التي سيتم استخدامها في الخطوات التالية.
    4. في اليوم 0 ، عالج الخلايا لمدة 24 ساعة بوسط صيانة الخلايا الجذعية الجنينية (انظر جدول المواد) مكملا بنسبة 2٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
    5. في اليوم 1-6 ، قم بتغيير الوسائط الكاملة بوسط تحريض عصبي دافئ (37 درجة مئوية) يحتوي على مثبطات SMAD من المجموعة التجارية (انظر جدول المواد). إذا انقسمت الخلايا ووصلت إلى التقاء قبل اليوم 7 ، فقم بتمريرها إلى كثافة البذر من 0.5-1 × 106 ، كما هو موضح سابقا في الخطوة 1.1.3.
    6. في اليوم 7 ، قم بتمرير الشخصيات غير القابلة للعب باستخدام محلول انفصال الخلية (انظر جدول المواد) والصفيحة بكثافة بذر 1-2 × 105 خلايا / بئر من صفيحة 24 بئرا.
    7. كفاءة تمايز الفحص عن طريق تلطيخ الكيمياء المناعية (IHC) لعدم وجود علامات متعددة القدرات ، مثل OCT4 ، ووجود علامات NPC ، مثل PAX6 و Nestin و Sox1.
    8. في هذه المرحلة ، يمكن تجميد الشخصيات غير القابلة للعب المنفصلة في وسائط التجميد التجارية المتخصصة NPC (انظر جدول المواد) وتخزينها في النيتروجين السائل لمدة تصل إلى 3 أشهر. بعد التجميد والذوبان لمرة واحدة ، لا تزال الشخصيات غير القابلة للعب تحتفظ بالقدرات المتعددة لإحداث الخلايا العصبية والخلايا النجمية و OPCs ببروتوكولات موثوقة.
  2. توليد الخلايا السليفة قليلة التغصن (OPC) (~ 7 أيام). يرجى الاطلاع على الشكل 1 أ للاطلاع على مخطط التدفق.
    1. في اليوم 7 ، قم بتمرير الشخصيات غير القابلة للعب باستخدام محلول انفصال الخلية (انظر جدول المواد) وقم بوضعها بكثافة بذر 1-2 × 105 خلايا لكل بئر في صفيحة 24 بئرا في وسط تحريض عصبي دافئ (37 درجة مئوية) بالإضافة إلى مثبطات SMAD من المجموعة التجارية (انظر جدول المواد).
    2. في اليوم 8 ، قم بإعداد محلول 1٪ DMSO في وسط تمايز OPC ومعالجة الشخصيات غير القابلة للعب المطلية لمدة 24 ساعة. يتكون وسيط التمايز OPC من: متوسط قاعدي (DMEM / F12) ، مكمل N2 1٪ ، مكمل B27 ٪ ، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) عند 20 نانوغرام / مل ، ناهض ممعم (SAG) عند 1 ميكرومتر ، عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF-AA) عند 10 نانوغرام / مل (انظر جدول المواد).
    3. في اليوم 9 ، استبدل الوسائط بوسيط تمايز OPC جديد بدون DMSO. قم بإطعام الخلايا كل يومين حتى اليوم 15. إذا وصلت الخلايا إلى التقاء قبل اليوم 15 ، فقم بتمريرها إلى كثافة البذر من 1-2 × 105 خلايا لكل بئر ، كما هو موضح في الخطوة 1.2.1.
    4. في اليوم 14 ، لوحة OPCs في وسط تمايز OPC بكثافة 1-2 × 105 خلايا / بئر في صفيحة 24 بئرا.
    5. في هذه المرحلة (اليوم 15), خلايا اختبار لوجود علامات خاصة OPC عن طريق الكيمياء المناعية (IHC) تلطيخ أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) (على سبيل المثال, O4, Olig1/2, CSPG4/Ng2, NKX2.2, PDGFRa; الشكل 1 ب) ولعدم وجود علامات NPC (Pax6 أو Nestin ؛ الشكل 1 د). نكتشف عادة النشاط المناعي O4 في أكثر من 95٪ من الخلايا في اليوم 15. من الأهمية بمكان لمرض الزهايمر ، فإن التعبير عن APP (بروتين سلائف الأميلويد) ، و BACE1 (معالجة البروتياز β-سيكريتاز 1) ، والببتيد أميلويد β (Aβ) وفيرة في OPCs (الشكل 1F).
  3. نضوج الخلايا قليلة التغصن (OL) (~ 7-20 يوما)
    1. في اليوم 15 ، استبدل الوسائط بوسط نضج OL: وسط Neurobasal-A ، مكمل B27 2٪ ، 1 ميكرومتر أحادي فوسفات الأدينوزين الدوري (cAMP) ، 200 نانوغرام / مل T3 ثلاثي يودوثيرونين ، وكليماستين 1 ميكرومتر (انظر جدول المواد). قم بتغيير الوسيط كل يومين أو كل يوم ، إذا لزم الأمر.
    2. عندما تصل الخلايا إلى 90٪ من التقاء ، تنقسم بنسبة 1: 3 حتى ممرين أو حتى يتباطأ انقسام الخلية بشكل كبير. إذا انقسمت OPCs بسرعة كبيرة ووصلت إلى التقاء في أقل من 3 أيام ، أضف Ara-C (انظر جدول المواد) بتركيز 2-5 ميكرومتر لمدة 1-3 أيام. يشير الانتشار النشط إلى انخفاض كفاءة النضج.
    3. افحص كفاءة النضج قليل التغصن من خلال تقييم التعبير عن علامات OL ، على سبيل المثال ، CLDN11 أو PLP1 أو MBP بواسطة qPCR أو تلطيخ IHC أو النشاف المناعي. يجب اكتشاف التشكل المميز للهياكل المعقدة للغاية (الشكل 1 ج) والتعبير عن علامات OL (الشكل 1E) بسهولة بحلول اليوم 28.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: توليد iOPC (خلية سلائف قليلة التغصن المستحثة) ونضج iOL (الخلايا قليلة التغصن المستحثة). (أ) مخطط التدفق لتوليد iOPC و iOL. (ب) تمثيل صور المجال الساطع والتألق المناعي ل iOPCs في اليوم 15. يظهر Olig2 (علامة عموم الدبقيات قليلة التغصن) باللون الأخضر ، و O4 (علامة OPC) باللون الأحمر ، و DAPI باللون الأزرق. كشف التصوير أن >95٪ من iOPCs إيجابية ل O4...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أكوتاز تقنيات STEMCELL 7920 مكمل B27 ثيرموفيشر 17504044 bFGF ثيرموفيشر دك 0266 معسكر MilliporeSigma أ 9501 كليماستين MilliporeSigma SML0445 DMEM / F12 متوسط تقنيات STEMCELL 36254 DMSO ثيرموفيشر د12345 مصل الأبقار الجنينية الخلية العلمية 10 H1 الخلايا الجذعية الجنينية البشرية واي سيل WA01 ماتريجيل كورنينج 354234 mTeSR بلس تقنيات STEMCELL 5825 مكمل N2 ثيرموفيشر 17502001 العصبي المتوسط أ ثيرموفيشر 10888-022 الأحماض الأمينية غير الأساسية ثيرموفيشر 11140-050 PDGF-AA أنظمة البحث والتطوير 221-AA-010 pMDLg / pRRE أدجين هاتف 12251 بوليبرين MilliporeSigma TR-1003-G [بروسف-ريف] أدجين هاتف 12253 مثبط الصخور Y-27632 تقنيات STEMCELL 72302 تبلد توكرس 4366 STEMdiff السلف العصبي تجميد الوسائط تقنيات STEMCELL 5838 طقم الحث العصبي STEMdiff SMADi تقنيات STEMCELL 8581 T3 ثلاثي يودوثيرونين MilliporeSigma تي 6397 Tempo-iOlogo: OPCs البشرية المشتقة من iPSC تيمبو بيوساينس رقم المنتج102 تيتو-نغ2-بورو أدجين 52047 في إس في-جي أدجين هاتف 12259

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SMAD DMSO Ara C

مقالات ذات صلة