مقالة منهجية

طريقة للثقافة المشتركة لنمذجة تفاعلات الخلايا العصبية قليلة التغصن

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Assetta، B.، et al. جيل الخلايا العصبية البشرية والخلايا قليلة التغصن من الخلايا الجذعية متعددة القدرات لنمذجة تفاعلات الخلايا العصبية قليلة التغصن. ج. فيس. إكسب. (2020).

يوضح هذا الفيديو إنشاء ثقافة مشتركة للخلايا العصبية المستحثة البشرية (iNs) والخلايا السليفة المستحثة للخلايا الدبقية قليلة التغصن (iOPCs). يتم خلط iNs مع iOPCs في ثقافة مشتركة ثم يتم احتضانها لدعم نضج كل من iNs إلى خلايا عصبية و iOPCs إلى خلايا الدبقية قليلة التغصن. تشكل الخلايا العصبية روابط متشابكة مع الخلايا العصبية الأخرى والخلايا قليلة التغصن ، بينما تطور الخلايا الدبقية قليلة التغصن أغلفة المايلين حول محاور الخلايا العصبية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تحريض الخلايا العصبية البشرية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

  1. تحضير فيروس العدسات (~ 5 أيام)
    1. لوحة ~ 1 مليون كلية جنينية بشرية 293T (HEK293T) خلية كل قارورة T75 ، لجعلها ~ 40٪ ملتقية عند إجراء التعداد. قم بنقلها باستخدام البلازميدات التي تعبر عن neurogenin المحفز للتتراسيكلين 2 (Ngn2) والجين المقاوم للبورومايسين (PuroR ؛ تحت نفس التحكم في محفز مشغل Tet (TetO) ، ومنشط التتراسيكلين العكسي (rtTA) والبلازميدات المساعدة الثلاثة pRSV-REV و pMDLg / pRRE و VSV-G (12 ميكروغرام من الحمض النووي الناقل الفيروسي و 6 ميكروغرام من كل من الحمض النووي البلازميد المساعد). قم بإعداد ثلاث قوارير على الأقل لكل مستحضر للفيروس. استخدام البولي إيثيلينيمين (PEI) للتعداء باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بتغيير الوسائط بعد 16 ساعة وتجاهلها.
      2. أطلق
    2. الحصاد جزيئات فيروسية عن طريق جمع وسائط الاستزراع كل يوم واستبدالها بوسائط جديدة لمدة 3 أيام. تجمع الوسائط المجمعة التي تحتوي على جزيئات فيروسية للتنقية. قم بتصفية الفيروس من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر وجهاز طرد مركزي عند 49,000 × جم لمدة 90 دقيقة. أعد تعليق الحبيبات في الحجم المناسب من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) - الجلوكوز (~ 150 ميكرولتر).
  2. تحريض الخلايا العصبية (~ 5 أيام) < / > ملاحظه: بروتوكول الحث هذا (الشكل 1 أ ؛ مخطط التدفق) فعال للغاية لكل من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS) والخلايا الجذعية الجنينية (ES) ذات القدرة المتعددة التي تم التحقق من صحتها (والتي يمكن فحصها عن طريق تلطيخ الكيمياء المناعية لعلامات تعدد القدرات المميزة بشكل جيد. الشكل 1 ب).
    1. استخدم خلايا الجذع الجنينية البشرية H1 المتوفرة تجاريا عند مرور 52 (انظر جدول المواد). قم بزراعة الخلايا على محلول مصفوفة خارج الخلية مطلي بألواح 6 آبار (~ 0.5 مجم من محلول المصفوفة لكل صفيحة ذات 6 آبار ؛ انظر جدول المواد) باستخدام وسيط صيانة الخلايا ES (انظر جدول المواد) واحتضان الألواح عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    2. في اليوم -2 ، افصل الخلايا الجنينية الجنينية (80٪ ملتقية) مع 1 مل من محلول انفصال الخلية (انظر جدول المواد) واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. انقل الخلايا إلى أنبوب ؛ اغسل البئر ب 2 مل من الوسائط واجمعها في نفس الأنبوب. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، قم بتعليق الحبيبات في الوسائط ، وقم بوضع الخلايا على ألواح مصفوفة مطلية ب 6 آبار بكثافة بذر 1 × 105 خلايا لكل بئر.
    3. في اليوم -1 ، أضف فيروسات العدسات التي تعبر عن Ngn2 بالإضافة إلى PuroR و rtTA مع البوليبرين (8 ميكروغرام / مل) إلى الخلايا الجذعية الجنينية في وسط صيانة الخلايا الجذعية الجنينية الطازجة (انظر جدول المواد). يجب تحديد العدد الدقيق للفيروسات من خلال العيار الفعلي أو المعايرة بالتحليل الكيميائي. نضيف عادة 5 ميكرولتر لكل فيروس لكل بئر في طبق مكون من 6 آبار.
    4. في اليوم 0 ، أضف دوكسيسيكلين (2 ميكروغرام / مل ، لتنشيط تعبير Ngn2) في وسط النسر المعدل / خليط المغذيات F-12 (DMEM-F12) مع مكمل N2 بدون مورفوجينات.
    5. في اليوم 1 ، أضف Puromycin في وسط طازج من DMEM-F12 بالإضافة إلى N2 و doxycycline ، إلى التركيز النهائي البالغ 1 ميكروغرام / مل متوسط. حدد الخلايا المنقولة في بوروميسين لمدة 24 ساعة على الأقل. قد تكون هناك حاجة إلى تركيز أعلى من بورومايسين (حتى 5 ميكروغرام / مل) وفترة اختيار أطول (تصل إلى 48 ساعة) لإزالة الخلايا غير المنقولة بشكل كاف إذا كان عيار الفيروس منخفضا.
    6. في اليوم 2 ، افصل الخلايا العصبية المتمايزة بمحلول انفصال الخلية (انظر جدول المواد) ، وأعد لصقها على ألواح 24 بئرا (بين 80.000-200.000 خلية / بئر) مغلفة بمحلول مصفوفة (انظر جدول المواد) ، واحتفظ بها في وسط عصبي قاعدي A (NBA) / B27 بدون دوكسيسيكلين. كثافة البذر أمر بالغ الأهمية.
    7. في هذه المرحلة ، يمكن تجميد الخلايا العصبية المنفصلة في وسط تجميد تجاري متخصص (انظر جدول المواد) وتخزينها في النيتروجين السائل لمدة تصل إلى 3 أشهر. يمكن طلاء الخلايا العصبية النقية التي تمثل الموت الخلوي النموذجي ~ 15٪ -20٪ بعد الذوبان ، أو زراعتها بمفردها أو مزروعة مشتركة مع أنواع خلايا الدماغ الأخرى (انظر الخطوة 3.2.3. للزراعة المشتركة مع OPCs).
    8. استزراع iNs النقي على الألواح المطلية بمحاليل قائمة على المصفوفة خارج الخلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). يجب أن يكون التشكل الهرمي المميز واضحا بحلول اليوم 4 (واليوم 6 ؛ الشكل 1 ج). يمكن اكتشاف تكوين المشبك في وقت مبكر من اليوم 14 إلى 16 وهو بارز في اليوم 24 عن طريق التلوين الكيميائي المناعي باستخدام علامات قياسية قبل وبعد التشابك. (الشكل 1D ؛ المسمى بعلامة ما قبل التشابك Synapsin 1 وعلامة التغصني Map2).
< p class = "jove_title" >2. تحريض الخلايا السليفة البشرية قليلة التغصن (OPCs) من الخلايا الجذعية متعددة القدرات ونضوج الخلايا قليلة التغصن

  1. توليد الخلية السلفية العصبية (NPC): بروتوكول أحادي الطبقة (~ 7 أيام). انظر الشكل 2 أ للحصول على مخطط التدفق.
    1. زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية H1 كما هو موضح سابقا (انظر الخطوة 1.2.1) وقم بتمايزها إلى خلايا سلفية عصبية (NPCs) من خلال نهج راسخ يسمى SMADi المزدوج ، مع مثبطات جزيئات صغيرة لمسارات إشارات متعددة. هنا نستخدم مجموعة تجارية مقبولة على نطاق واسع ونتبع بروتوكول أحادي الطبقة الذي توفره الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    2. في اليوم -1 ، لوحة 0.5-1 × 106 خلايا لكل بئر في صفيحة مكونة من 6 آبار مطلية بمحلول مصفوفة مخفضل لعامل النمو (انظر جدول المواد ؛ ~ 0.5 مجم من محلول المصفوفة لكل لوحة ذات 6 آبار) مع وسيط صيانة الخلايا ES (انظر جدول المواد). يستخدم محلول المصفوفة المخفض لعامل النمو هذا لتغطية جميع الألواح التي سيتم استخدامها في الخطوات التالية.
    3. في اليوم 0 ، عالج الخلايا لمدة 24 ساعة بوسيط صيانة الخلايا الجذعية الجنينية (انظر جدول المواد) مكملا بنسبة 2٪ DMSO.
    4. في اليوم 1-6 ، قم بتغيير الوسائط الكاملة بوسط الحث العصبي الدافئ (37 درجة مئوية) الذي يحتوي على مثبطات SMAD من المجموعة التجارية (انظر جدول المواد). إذا انقسمت الخلايا ووصلت إلى التقاء قبل اليوم السابع ، فقم بتمريرها إلى كثافة البذر من 0.5-1 × 106 ، كما هو موضح سابقا في الخطوة 2.1.2.
    5. في اليوم 7 ، قم بتمرير الشخصيات غير القابلة للعب باستخدام محلول انفصال الخلية (انظر جدول المواد) والصفيحة بكثافة بذر 1-2 × 105 خلايا / بئر من صفيحة 24 بئرا.
    6. قم بفحص كفاءة التمايز عن طريق تلطيخ الكيمياء المناعية (IHC) لعدم وجود علامة متعددة القدرات ، وعامل النسخ المرتبط بالأوكتامير 4 (OCT4) على سبيل المثال ، ووجود علامات NPC مثل المربع المقترن 6 (PAX6) ، Nestin ، ومنطقة تحديد الجنس Y-box عامل النسخ 1 (Sox1).
    7. في هذه المرحلة ، يمكن تجميد الشخصيات غير القابلة للعب المنفصلة في وسائط التجميد التجارية المتخصصة NPC (انظر جدول المواد) وتخزينها في النيتروجين السائل لمدة تصل إلى 3 أشهر. بعد التجميد والذوبان لمرة واحدة ، لا تزال الشخصيات غير القابلة للعب تحتفظ بالقدرات المتعددة لإحداث الخلايا العصبية والخلايا النجمية و OPCs ببروتوكولات موثوقة.
  2. توليد الخلايا السليفة قليلة التغصن (OPC) (~ 7 أيام). يرجى الاطلاع على الشكل 2 أ للاطلاع على مخطط التدفق.
    1. في اليوم 7 ، قم بتمرير الشخصيات غير القابلة للعب باستخدام محلول انفصال الخلية (انظر جدول المواد) وقم بوضعها بكثافة بذر 1-2 × 105 خلايا لكل بئر في صفيحة 24 بئرا في وسط تحريض عصبي دافئ (37 درجة مئوية) بالإضافة إلى مثبطات SMAD من المجموعة التجارية (انظر جدول المواد).
    2. في اليوم 8 ، قم بإعداد محلول 1٪ من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في وسط تمايز OPC ومعالجة الشخصيات غير القابلة للعب المطلية لمدة 24 ساعة. يتكون وسيط تمايز OPC من: DMEM / F12 المتوسط ، 1٪ N2 الملحق ، 1٪ B27 ، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) عند 20 نانوغرام / مل ، ناهض ممعم (SAG) عند 1 ميكرومتر ، عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - AA (PDGF-AA) عند 10 نانوغرام / مل (انظر جدول المواد).
    3. في اليوم 9 ، استبدل الوسائط بوسيط تمايز OPC جديد بدون DMSO. قم بإطعام الخلايا كل يومين حتى اليوم 15. إذا وصلت الخلايا إلى التقاء قبل اليوم 15 ، فقم بتمريرها إلى كثافة البذر 1-2 × 105 خلايا لكل بئر كما هو موضح في الخطوة 2.2.1.
    4. في اليوم 14 ، لوحة OPCs في وسط تمايز OPC بكثافة 1-2 × 105 خلايا / بئر في صفيحة 24 بئرا.
    5. في هذه المرحلة (اليوم 15) ، اختبر الخلايا لوجود علامات خاصة ب OPC عن طريق تلطيخ IHC أو qPCR (على سبيل المثال ، O4 ، عامل نسخ نسب الخلايا الدبقية قليلة التغصن [Olig] -1/2 ، كبريتات شوندروتن البروتيوغليكان 4 / مستضد الخلايا العصبية الدبقية 2 [CSPG4 / Ng2 [، NK2 Homeobox 2 [NKX2.2] ، مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية ألفا [PDGFRa] ؛ الشكل 2 ب) ولعدم وجود علامات NPC (Pax6 أو Nestin ؛ الشكل 2 د). نكتشف عادة النشاط المناعي O4 في أكثر من 95٪ من الخلايا في اليوم 15. من الأهمية بمكان لمرض الزهايمر ، فإن التعبير عن APP (بروتين سلائف الأميلويد) ، و BACE1 (بروتياز المعالجة β-secreatase 1) ، والببتيد أميلويد β (Aβ) وفير في OPCs (الشكل 2F).
< p class = "jove_title">3. الزراعة المشتركة للخلايا العصبية المستحثة البشرية (iNs) والخلايا السليفة قليلة التغصن (iOPCs)

  1. طلاء iOPC (~ 3 أيام)
    1. لوحة iOPCs في اليوم 14 بكثافة 1 × 105 خلايا لكل بئر في صفيحة 24 بئرا (كما هو موضح أعلاه في الخطوة 2.2.4.) في وسط تمايز OPC (كما هو موضح في الخطوة 2.2.2.).
  2. إعداد الثقافة المشتركة iN-iOPC
    1. في اليوم 15 ، افصل الخلايا العصبية البشرية المستحثة في خطوة اليوم 2 بعد اختيار Puromycin (كما هو موضح في الخطوة 1.2.6) بمحلول انفصال الخلية (انظر جدول المواد).
    2. أضف الخلايا العصبية إلى OPCs المستنبتة ، مع الطلاء بكثافة البذر 2 × 105 خلايا لكل بئر في صفيحة 24 بئرا مع نمو OPCs (من الخطوة 3.1.1). استخدم وسط الزراعة المشتركة الذي يحتوي على وسط Neurobasal-A ، ومكمل B27 2٪ ، و 100 نانوغرام / مل T3 ثلاثي يودوثيرونين. قم بتغيير الوسيط في اليوم التالي ثم كل يومين بعد ذلك. إذا تكاثرت OPCs بسرعة كبيرة ووصلت إلى التقاء في أقل من 3 أيام ، أضف السيتوزين أرابينوسيد (Ara-C) بتركيز 2-5 ميكرومتر. تظهر صورة تمثيلية ل iNs و iOPCs المزروعة في الزراعة المشتركة بعد 7 أيام من الخلايا العصبية في الشكل 3 أ.
    3. استخدم الخلايا العصبية المجمدة المحضرة كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.2.7 للزراعة المشتركة مع OPCs. لوحة تجميد وذوبان الخلايا العصبية بكثافة أعلى من 3 × 105 خلايا لكل بئر.
    4. بعد اليوم 14-16 في الثقافات المشتركة ، يمكن ملاحظة تكوين المشبك في iNs عن طريق تلطيخ IHC لعلامات ما قبل وبعد التشابك ، وبحلول اليوم 21 يجب أن تكون النقاط المشبكية وفيرة (الشكل 3C) ويمكن تسجيل الأنشطة العصبية بشكل موثوق.
    5. بدءا من اليوم 21 ، اختبر الخلايا بحثا عن علامات محددة ل OL (على سبيل المثال ، بروتين المايلين الأساسي [MBP] وبروتين البروتينات 1 [PLP1]). بحلول اليوم 28 ، نلاحظ عادة ظاهرة تغليف محاور iN بواسطة عمليات iOL ، المسماة بتلطيخ IHC لعلامات محددة (الشكل 3 ب ؛ خيوط عصبية [NF] لمحاور iN و MBP لعمليات iOPC).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: التوليد المباشر للخلايا العصبية المستحثة البشرية (iNs) من hPSCs. (أ) مخطط تدفق توليد iN. (ب) تمثيل صور المجال الساطع والتألق المناعي لثقافة البداية للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (H1) لتأكيد تعدد القدرات. يظهر Oct4 باللون الأحمر و Sox2 باللون الأخضر. (ج) صور ميدانية مشرقة تمثيلية ل iNs في اليومين 4 و6. (د)...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أكوتاز تقنيات STEMCELL 7920 مكمل B27 ثيرموفيشر 17504044 bFGF ثيرموفيشر دك 0266 معسكر MilliporeSigma أ 9501 كليماستين MilliporeSigma SML0445 DMEM / F12 متوسط تقنيات STEMCELL 36254 DMSO ثيرموفيشر د12345 الدوكسيسيكلين MilliporeSigma د3072 مصل الأبقار الجنينية الخلية العلمية 10 H1 الخلايا الجذعية الجنينية البشرية واي سيل WA01 ماتريجيل كورنينج 354234 mTeSR بلس تقنيات STEMCELL 5825 مكمل N2 ثيرموفيشر 17502001 العصبي المتوسط أ ثيرموفيشر 10888-022 الأحماض الأمينية غير الأساسية ثيرموفيشر 11140-050 PDGF-AA أنظمة البحث والتطوير 221-AA-010 بي VWR 71002-812 pMDLg / pRRE أدجين هاتف 12251 بوليبرين MilliporeSigma TR-1003-G [بروسف-ريف] أدجين هاتف 12253 بوروميسين ثيرموفيشر A1113803 مثبط الصخور Y-27632 تقنيات STEMCELL 72302 تبلد توكرس 4366 STEMdiff السلف العصبي تجميد الوسائط تقنيات STEMCELL 5838 طقم الحث العصبي STEMdiff SMADi تقنيات STEMCELL 8581 T3 ثلاثي يودوثيرونين MilliporeSigma تي 6397 Tempo-iOlogo: OPCs البشرية المشتقة من iPSC تيمبو بيوساينس رقم المنتج102 تيتو-نغ2-بورو أدجين 52047 في إس في-جي أدجين هاتف 12259

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة