يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تقنية لتوليد طبقة أحادية ثنائية الأبعاد من الخلايا المخيخية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات

900 مشاهدات

⸱

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

المصدر: Madencioglu ، D. A. ، et al. نمذجة تطور المخيخ البشري في المختبر في هيكل ثنائي الأبعاد.J. Vis. Exp. (2022).

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا للتمييز بين الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية إلى أسلاف مخيخية. يتضمن نقل مستعمرات الخلايا الجذعية إلى صفيحة تعلق منخفضة للغاية لتشكيل أجسام جنينية ، وتعزيز التمايز مع عوامل النمو ، ثم نقل الأجسام الجنينية إلى صفيحة مغلفة بالمصفوفة للالتصاق. تتضمن الخطوات اللاحقة تحفيز هجرة الخلايا وإضافة وسيط النضج لتوجيه تطور السلائف العصبية المخيخية الجلوتاماتية وGABAergic وأسلاف خلايا بركنجي.

البروتوكول

< ص الفئة = "jove_title" >1. التحضير التجريبي

  1. تحضير مصفوفة الغشاء القاعدي (BMM) الألواح المطلية ب
    ملاحظه: يتجمد BMM بسرعة أكبر في درجات الحرارة الأكثر دفئا. يجب تحضير الأطباق بسرعة ووضعها على الفور عند 4 درجات مئوية للتخزين.
    1. قم بإذابة BMM (انظر جدول المواد) على الجليد ، عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين على الأقل ، أو بين عشية وضحاها.
    2. امزج وسط النسر المعدل (DMEM) / F12 و BMM من Dulbecco بتركيز نهائي يبلغ 80 ميكروغرام / مل. قم بتوزيع محلول BMM في أطباق زراعة الأنسجة (1 مل ل 35 مم و 2 مل للأطباق 60 مم) واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل أو طوال الليل قبل طلاء الخلايا.
      ملاحظة: يمكن تخزين الأطباق غير المستخدمة عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين.
  2. قم بإعداد ألواح مطلية ب poly-L-ornithine / laminin (PLO / laminin).
    1. قم بإعداد 20 ميكروغرام / مل PLO (انظر جدول المواد) في محلول ملحي معقم بالفوسفات من Dulbecco (DPBS +/+) وأضف 1 مل إلى كل بئر من صفيحة 6 آبار. احتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.
    2. في اليوم التالي ، قم بشفط منظمة التحرير الفلسطينية باستخدام شفاط فراغ واغسله مرتين باستخدام DPBS +/+. يجف في الهواء في غطاء المحرك.
      ملاحظة: يمكن تخزين الألواح المجففة بالهواء عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين ، ملفوفة بورق الألمنيوم ، للاستخدام في المستقبل.
    3. قم بإعداد 10 ميكروغرام / مل من اللامينين (انظر جدول المواد) في DPBS +/+ وأضف 1 مل إلى كل بئر من صفيحة 6 آبار. احتضن لمدة 3 ساعات على الأقل أو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.
    4. قم بشفط اللامينين باستخدام شفاط فراغ وأضف إما 1 مل من DPBS +/+ .
      متوسط أو معقم ملاحظة: يجب ألا يجف طلاء اللامينين. يجب إضافة PBS أو وسيط ثقافة مناسب على الفور لمنع ذلك. يمكن تخزين الألواح المطلية عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  3. تحضير حل تمرير PSC.
    1. قم بإذابة 11.49 جم من كلوريد البوتاسيوم (KCl) و 0.147 جم من ثنائي هيدرات سترات الصوديوم (HOC (COONa) (CH2COONa) 2 * 2H2O) في 400 مل من الماء المعقم لزراعة الخلايا (انظر جدول المواد).
    2. قم بقياس حجم المحلول وتسجيله كمجلد أولي (Vi).
    3. قم بقياس الأسمولية وضبطها على 570 مللي أسمول عن طريق إضافة ماء معقم لزراعة الخلايا باستخدام الصيغة Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
    4. قم بتعقيم المحلول بفلتر 0.20 ميكرومتر وقم بعمل 10 مل من الحصص الصغيرة. قم بتخزين الحصص في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  4. تحضير الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSC) متوسطة.
    ملاحظة: يتم الحفاظ على iPSCs في وسط يحتوي على عامل نمو الخلايا الليفية المستقر للحرارة 2 (FGF2) (انظر جدول المواد), توفير جدول تغذية مجاني في عطلة نهاية الأسبوع. لم يتم تجربة وسائط PSC الأخرى المتاحة تجاريا لهذا البروتوكول.
    1. قم بإذابة المكمل المتوسط PSC طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    2. أضف 10 مل من المكملات الغذائية المتوسطة PSC إلى 500 مل من وسط PSC الأساسي. اصنع 25 مل من كميات كبيرة واحفظها في درجة حرارة -20 درجة مئوية < br / > ملاحظة: يمكن تخزين الحصص المجمدة في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر. يجب تخزين الكميات المذابة في درجة حرارة 4 درجات مئوية واستخدامها في غضون أسبوعين. يمكن تجميد الخلايا للتخزين طويل الأمد في وسط PSC مع 10٪ (v / v) ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
  5. تحضير وسط ذوبان PSC.
    1. استكمل وسط PSC بكرومان 50 نانومتر ، و 1.5 ميكرومتر إمريكاسان ، و 1x مكمل بولي أمين ، و 0.7 ميكرومتر عبر ISRIB (كوكتيل CEPT) (انظر جدول المواد).
    2. قم بالفلتر والتعقيم باستخدام فلتر 0.20 ميكرومتر وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
  6. تحضير الماصات الزجاجية المسحوبة.
    1. اسحب ماصات باستور الزجاجية مقاس 22.9 سم (9 بوصات) إلى قطعتين فوق موقد بنسن، ~2 سم أسفل الرقبة، مما يؤدي إلى إنشاء ماصتين، بحيث يكون الجانب الرفيع أقصر ~4 سم من الآخر.
    2. بمساعدة اللهب ، قم بثني أطراف الجانب المسحوب لإنشاء "r" ناعم.
    3. ضع الماصات المسحوبة في أكمام الأوتوكلاف والأوتوكلاف للتعقيم.
  7. تحضير وسط التمايز المخيخي (CDM).
    1. امزج مزيج المغذيات Dulbecco المعدل من Iscove (IMDM) ومزيج المغذيات Ham's F12 بنسبة 1: 1. استكمل المزيج بمكمل 1x L-alanine-L-glutamine ، و 1٪ (v / v) مركز دهني محدد كيميائيا ، و 0.45 ملي مولار 1-ثيو جلسرين ، و 15 ميكرولتر / مل apo-transferrin ، و 5 مجم / مل من ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، و 7 ميكروغرام / مل من الأنسولين (انظر جدول المواد).
    2. قم بتعقيمها بالفلتر باستخدام فلتر 0.20 ميكرومتر ، وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية ، واستخدمها في غضون شهر واحد.
  8. تحضير وسط نضج المخيخ (CMM).
    1. استكمل الوسط العصبي مع 1x L-alanine-L-glutamine مكمل و 1x N-2 (انظر جدول المواد).
    2. قم بتعقيمه بالفلتر باستخدام فلتر 0.20 ميكرومتر ، وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية ، واستخدمه في غضون أسبوعين.

2. ثقافة iPSC خالية من المغذيات

  1. قم بإذابة الخلايا باتباع الخطوات أدناه.
    1. ضع لوحة BMM (الخطوة 1.1) في الحاضنة 37 درجة مئوية للهلام لمدة ساعة واحدة على الأقل أو طوال الليل قبل إذابة الخلايا.
    2. قم بتسخين 10 مل من وسط ذوبان PSC (الخطوة 1.5) عند 37 درجة مئوية.
    3. انقل التبريد بالخلايا من النيتروجين السائل إلى حمام مائي عند 37 درجة مئوية
      ملاحظة: لتجنب توليد مصدر للتلوث في مساحة زراعة الخلايا ، لا ينصح باستخدام حمام مائي قياسي. بدلا من ذلك ، يمكن تسخين المياه العذبة في دورق صغير إلى 37 درجة مئوية لتوليد حمام مائي يستخدم لمرة واحدة.
    4. عندما تكون هناك قطعة صغيرة من الثلج متبقية في الأنبوب ، أخرجها من الحمام المائي ، وجفف الأنبوب ، ورشه بنسبة 70٪ من الإيثانول. انقل الأنبوب إلى غطاء المحرك واستخدم ماصة مصلية سعة 2 مل أو 5 مل (انظر جدول المواد) لنقل الخلايا برفق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    5. أضف 8 مل من وسط ذوبان PSC إلى الخلايا بالتنقيط أثناء تدوير الأنبوب المخروطي. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
      6. قم
    6. بشفط المادة الطافية بعناية باستخدام شفاط فراغ دون إزعاج حبيبات الخلية. أعد تعليق الخلايا في 2 مل من وسط ذوبان PSC.
    7. قم بشفط BMM من اللوحة وأضف الخلايا المعلقة بالتنقيط في جميع أنحاء اللوحة للتوزيع المتساوي.
    8. ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. قم بتحديث الوسيط في اليوم التالي باستخدام وسيط PSC. بعد ذلك ، قم بتغيير الوسيط يوميا.
  2. حافظ على الخلايا باتباع الخطوات أدناه.
    1. قم بتسخين الحجم اللازم لوسط PSC مسبقا عند 37 درجة مئوية (على سبيل المثال ، 1 مل من الوسط لكل لوح 35 مم).
    2. افحص الألواح بحثا عن الخلايا أو المستعمرات المتمايزة وقم بإزالة الخلايا المتمايزة بماصة زجاجية مسحوبة (الخطوة 1.6).
      ملاحظة: مستعمرات iPSC لها حواف ناعمة مع خلايا متطابقة شكليا.
    3. قم بتغيير الوسيط الذي يتم إنفاقه يوميا والمرور كل 3-4 أيام أو عند الوصول إلى 70٪ من التقاء.
  3. تمرير الخلايا.
    1. ضع الكمية اللازمة من ألواح BMM في الحاضنة لمدة ساعة واحدة على الأقل أو طوال الليل قبل المرور. قم بتسخين الكمية اللازمة من وسط PSC مسبقا (الخطوة 1.3) عند 37 درجة مئوية.
    2. باستخدام ماصة زجاجية مسحوبة، قم بتنظيف أي خلايا أو مستعمرات متمايزة.
    3. قم بشفط الوسط المستهلك باستخدام شفاط فراغ وأضف وسط تفكك PSC ، 1 مل لكل طبق 35 مم. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 1-3 دقائق < br / > ملاحظة: إذا كانت المستعمرات ترفع في محلول تمرير PSC قبل إضافة وسيط PSC ، فيمكن تقليل وقت الحضانة.
    4. قم بشفط محلول تمرير PSC وأضف وسط PSC مسخن مسبقا.
    5. باستخدام طرف ماصة معقم سعة 200 ميكرولتر، قم بتدوير اللوحة بزاوية 90 درجة، وقم بعمل مجموعة ثانية من خطوط الخدش بشكل عمودي على الخطوط السابقة (مما يجعل النمط المتقاطع عبر اللوحة).
    6. استنشق محلول BMM من لوحات الضبط. اجمع المستعمرات باستخدام ماصة مصلية ووزعها على ألواح BMM الجديدة.
    7. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. قم بتغيير الوسيط يوميا.
  4. تجميد الخلايا.
    1. قم بإعداد المبردات عن طريق وضع ملصقات على المحتوى وتعقيمها تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) في غطاء المحرك (انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة.
    2. قم بإعداد وسط تجميد PSC عن طريق استكمال وسط PSC بنسبة 10٪ (حجم / حجم) DMSO. اتبع الخطوات 2.3.2-2.3.5.
    3. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل وجهاز طرد مركزي بمعدل 200 × جم لمدة 5 دقائق عند RT.
      4. قم
    4. بشفط الوسط بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في وسط تجميد PSC.
    5. وزعيها في cryovials. ضع القوارير في وعاء تجميد وضع الحاوية في فريزر -80 درجة مئوية.
    6. في اليوم التالي ، انقل المبردات إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.
< ص الفئة = "jove_title" >3. التمايز المخيخي

< ص فئة = "jove_content">ملاحظة: قبل البدء في التمايز, يتم تمرير iPSCs إلى ستة 35 أطباق مم وتكون جاهزة للتمايز عندما تكون في 70٪ التقاء. سيتم نقل كل صفيحة مقاس 35 مم إلى بئر واحد من اللوحة المكونة من 6 آبار.

  1. في اليوم 0, رفع مستعمرات iPSC صحية لتشكيل EB.
    1. أضف 1 مل من آلية التنمية النظيفة (الخطوة 1.7) مكملة ب 10 ميكرومتر Y-27632 و 10 ميكرومتر SB431542 (انظر جدول المواد) إلى كل بئر من صفيحة مرفقة منخفضة جدا (ULA) مكونة من 6 آبار وضعها في الحاضنة حتى تصبح المستعمرات المرفوعة جاهزة للإضافة إلى الآبار.
    2. قم بتنظيف الخلايا المتمايزة باستخدام ماصة زجاجية مسحوبة. قم بشفط الوسط وأضف 1 مل من محلول تمرير PSC لكل طبق 35 مم. احتضن لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية ، والشفط ، وأضف 2 مل من CDM مع 10 ميكرومتر Y-27632 و 10 ميكرومتر SB431542.
      ملاحظه: إذا كانت المستعمرات ترفع في محلول مرور PSC قبل إضافة آلية التنمية النظيفة ، فيمكن تقليل وقت الحضانة.
    3. تحت المجهر المقلوب بالضوء المنقول، ارفع المستعمرات برفق باستخدام الحافة المنحنية للماصة الزجاجية المسحوبة باستخدام تكبير 4x. بمجرد رفع كل مستعمرة ، انقل كل شيء برفق إلى بئر واحد من صفيحة ULA المكونة من 6 آبار باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل. كرر هذه العملية لكل لوحة iPSC. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
      ملاحظه: إذا كانت المستعمرات كبيرة جدا أو تم دمجها ، فيمكن تقطيعها بطرف الماصة الزجاجية المسحوبة لإنشاء EBs أصغر.
  2. في اليوم 2 ، أضف FGF2 إلى كل بئر إلى تركيز نهائي قدره 50 نانوغرام / مل < br / > ملاحظه: FGF2 المستخدم في تمايز المخيخ ليس مستقرا للحرارة. لم يتم اختبار هذا البروتوكول باستخدام FGF2 المستقر للحرارة.
  3. في اليوم 7 ، قم بإجراء تغيير متوسط 1/3. للحصول على 3 مل من الوسط الكلي في البئر ، باستخدام ماصة 1,000 ميكرولتر ، قم بشفط 1 مل من الوسط المستهلك برفق واستبدله ب 1 مل من CDM الطازج. احتضان EBs لمدة 7 أيام.
  4. في اليوم 14، قم بشفط كل الوسط المستهلك تقريبا باستخدام ماصة سعة 1,000 ميكرولتر. لضمان الحد الأدنى من الضرر الذي يلحق ب EBs ، قم بتدوير اللوحة لتجميع كل EBs في وسط اللوحة ، ثم قم بإمالة اللوحة والشفيق ببطء من الحافة.
    1. مع انخفاض الكمية المتوسطة ، ضع اللوحة ببطء مسطحة واستمر في الشفط. اترك وسيطا كافيا لتجنب تجفيف EBs. بعد ذلك ، أضف 3 مل من CDM الطازج المكمل ب 10 ميكرومتر Y-27632. انقل EBs باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل إلى طبق مطلي بطبقة PLO/laminin (الخطوة 1.2).
      ملاحظه: اعتمادا على التطبيق النهائي ، يمكن نقل EBs إلى لوحة PLO / laminin ذات 6 آبار أو يمكن نقل EBs مفردة إلى بئر واحد من صفيحة 24 بئرا مطلية ب PLO / laminin أو غطاء الغطاء.
  5. في اليوم 15 ، استنشق الوسيط واستبدله ب CDM.
    ملاحظه: من المهم إضافة وسيط كاف إلى الآبار لضمان وسيط كاف بين الوجبات حيث سيكون هناك تبخر بمرور الوقت (على سبيل المثال ، بالنسبة للبئر في صفيحة 6 آبار ، أضف 3 مل من المتوسط). إذا بدأ الوسط في التحمض (يتحول إلى اللون الصافي والأصفر) ، فقم بتحديث الوسط حتى لو لم يكن مدرجا في جدول التغذية حتى نهاية البروتوكول.
  6. في اليوم 21 ، استنشق الوسط المستهلك واستبدله ب CMM. في اليوم 28 ، قم بتغيير الوسط باستخدام CMM الطازج. في اليوم 35 ، حصاد الخلايا لمزيد من التطبيقات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 10 مل ماصة مصلية فيشر ساينتيك 13-678-26 د 1-ثيو الجلسرين سيغما م 6145 2 مل ماصة مصلية فيشر ساينتيك 13-678-26 ب وحدة فلتر 250 مل ، 0.2 ميكرومتر aPES ، قطر 50 مم فيشر ساينتيك FB12566502 35 مم طبق الأنسجة سهلة الإمساك صقر 353001 ماصة مصلية سعة 5 مل فيشر ساينتيك 13-678-25 د 60 مم طبق ثقافة الأنسجة سهل الإمساك صقر 353004 6 ألواح مرفقة منخفضة للغاية كورنينج 3471 9 "ماصات باستور يمكن التخلص منها فيشر ساينتيك 13-678-20 د أبو ترانسفيرين سيغما تي 1147 ألبومين مصل الأبقار (BSA) سيغما أ 9418 ماء الصف لثقافة الخلية سيتيفا SH30529.02 مركز الدهون المحدد كيميائيا جيبكو 11905031 كرومان 1 كايمان 34681 الفئة الثانية ، النوع A2 ، خزانة السلامة البيولوجية شركة NuAire، Inc. NU-540-600 غطاء محرك السيارة ، ضوء الأشعة فوق البنفسجية لوحة كوستار 24 بئر ، معالج بتقنية TC كورنينج 3526 طبق كوستار مكون من 6 آبار ، معالج بتقنية TC كورنينج 3516 DMEM جيبكو 11965092 DMEM / F12 جيبكو 11320033 DMSO (كبريتات ثنائي الميثلي) سيغما د2438 DPBS +/+ جيبكو 14040133 إمريكاسان كايمان هاتف: 22204 طقم إعادة برمجة Epi5 episomal iPSC تقنيات الحياة أ15960 أساسي 8-فليكس جيبكو A2858501 PSC متوسط مع FGF2 مستقر للحرارة مصل الأبقار الجنينية - Premium Select أتلانتا بيولوجيكس S11150 FGF2 بيبروتك 100-18 ب مكمل GlutaMAX جيبكو 35050061 مكمل L-alanine-L-glutamine هام F12 مزيج المغذيات جيبكو 11765054 حاضنة HERAcell VIOS 160i CO2 الترمو: العلمية 50144906 IMDM جيبكو 12440053 إنسولين جيبكو هاتف 12585 بروتين الفأر اللامينين جيبكو 23017015 ماتريكيل ماتريكس كورنينج 354234 مصفوفة الغشاء القاعدي ميم نيا جيبكو 11140050 جهاز طرد مركزي صغير لابنت الدولية سي 1310 جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة مكمل N-2 جيبكو 17502-048 الوسط العصبي القاعدي جيبكو 21103049 برنامج تلفزيوني ، درجة الحموضة 7.4 جيبكو 10010023 PFA 16٪ علوم المجهر الإلكتروني 15710 [م] مكمل بولي أمين سيغما ص 8483 بولي إل أورنيثين (منظمة التحرير الفلسطينية) سيغما 3655 ريال كلوريد البوتاسيوم سيغما 746436 SB431542 سيغما 54317 انظر من خلال الحقائب ذاتية الغلق Steriking SS-T2 (90 × 250) أكياس الأوتوكلاف ثنائي هيدرات سترات الصوديوم فيشر ساينتيك س 279-500 فلاتر الحقنة ، معقمة ، PES 0.22 ميكرومتر ، ضياء 30 مم المنتجات البحثية الدولية 256131 عبر ISRIB كايمان 16258 [إ] مقياس التناضح بضغط البخار شركة Wescor، Inc. نموذج 5520 مقياس التناضح Y-27632 الأحجار الحيوية 1293823

الوسوم

تقنية لتوليد طبقة أحادية ثنائية الأبعاد من الخلايا المخيخية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.