مقالة منهجية

توليد الخلايا العصبية والخلايا الدبقية من الأجسام الجنينية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة عن طريق الإنسان

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >المصدر: Pistollato، F.، et al. بروتوكول لتمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة عن طريق الإنسان إلى ثقافات مختلطة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية لاختبار السمية العصبية. J. Vis. Exp.(2017)

يوضح هذا الفيديو عملية تفريق الأجسام الجنينية (EBs) إلى مجاميع الظهارية العصبية وانقسامها اللاحق إلى خلايا عصبية ودبقية. تسمح هذه الطريقة بالتوليد الفعال للخلايا العصبية والدبقية في المختبر ، والتي تعمل كأنظمة اختبار لاختبار السمية بالإضافة إلى تقييم المسارات المختلفة المشاركة في السمية العصبية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. تمايز HiPSC إلى الخلايا العصبية المختلطة والخلايا الدبقية

ملاحظة: يستغرق الإجراء حوالي 28 يوما حتى يكتمل ، مع الخطوات الرئيسية الموضحة في الشكل 1.

  1. توليد الأجسام الجنينية (EBs) (أيام 0 → 1)
    ملاحظة:     يتطلب هذا الإجراء مهارات يدوية جيدة ودقة. يجب أن تكون شظايا مستعمرة HiPSC (الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية) متساوية الحجم للحصول على أجسام جنينية متجانسة (EBs) في الخطوات التالية. يجب التخلص من المستعمرات المتمايزة شكليا (مع الكسور السيتوبلازمية الكبيرة والنوى الصغيرة).
    1. قم بتحديث وسط hiPSC (3 مل / 60 مم طبق بتري) قبل قطع مستعمرات hiPSC غير المتمايزة (قطرها حوالي 1 مم ، انظر الشكل 2 أ) في ظل ظروف معقمة.
    2. قم بقص المستعمرات غير المتمايزة (كما هو موضح في الشكل 2 أ والشكل 2 ب) إلى أجزاء من حوالي 200 ميكرومتر × 200 ميكرومتر باستخدام حقنة سعة 1 مل بإبرة 30 جرام. استخدم مجهرا مجسما بتكبير 4X في خزانة تدفق رقائقي في درجة حرارة الغرفة.
    3. افصل شظايا المستعمرة عن سطح الطبق باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر عن طريق سحب الوسط برفق تحتها لرفع القطع.
    4. انقل جميع الأجزاء المنفصلة والوسط إلى أنبوب سعة 15 مل باستخدام ماصة سعة 1 أو 2 أو 5 مل.
    5. اشطف الطبق ب 2 مل من وسط hiPSC الكامل لاستعادة جميع الشظايا.
    6. جهاز طرد مركزي عند 112 × جم لمدة 1 دقيقة.
    7. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الشظايا برفق في 5 مل من وسط hiPSC EB الكامل (انظر جدول المواد).
    8. ضع شظايا المستعمرة في طبق بتري منخفض للغاية مقاس 60 مم (طبق بتري 5 مل / 60 مم).
    9. احتضن طبق بتري طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    10. في اليوم التالي (اليوم 1) ، اجمع EBs ووسطها في أنبوب سعة 15 مل باستخدام ماصة 1 أو 2 أو 5 مل.
    11. جهاز الطرد المركزي EBs عند 112 × جم لمدة 1 دقيقة.
    12. قم بسحب المادة الطافية بعناية وأعد تعليق EBs برفق في 5 مل من وسط hiPSC EB الكامل باستخدام ماصة 1 أو 2 أو 5 مل.
    13. أعد وضع EBs على طبق بتري جديد منخفض للغاية مقاس 60 مم (طبق بتري 5 مل / 60 مم).
    14. احتضن طبق بتري طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  2. في اليوم الأول ، قم بتغطية الأطباق بمصفوفة غشاء القاعدية (على سبيل المثال ، ماتريجيل ، المشار إليها فيما يلي باسم "المصفوفة القياسية") أو أي ركيزة بروتينية أخرى مناسبة (على سبيل المثال ، اللامينين).
    1. قم بتخزين المصفوفة القياسية (انظر جدول المواد) عند -80 درجة مئوية في حصص 200 ميكرولتر باستخدام أنابيب باردة سعة 1.5 مل وماصات باردة سعة 5 أو 10 مل.
    2. قم بإذابة 200 ميكرولتر من المصفوفة القياسية على الجليد.
    3. تمييع 200 ميكرولتر من المصفوفة القياسية في 20 مل من الوسط القاعدي (DMEM / F12) (تخفيف 1: 100).
    4. قم بتغطية أطباق بتري مقاس 60 مم بهذا المحلول (5 مل / طبق).
    5. احتضن الأطباق المطلية عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
      ملاحظه: سيتم استخدام هذه الأطباق لطبق EBs (حوالي 50 EBs / طبق) وتوليد مجاميع الظهارة العصبية (وريدات). انظر الخطوة 1.3.
  3. توليد المجاميع الظهارية العصبية (الوريدات) (الأيام 2 → 7)
    1. في اليوم 2 ، قم بإزالة محلول طلاء المصفوفة القياسي من أطباق بتري مقاس 60 مم (لا حاجة لشطف الألواح) واملأها ب 5 مل / طبق من وسط الحث الظهاري العصبي الكامل (NRI) ؛ انظر جدول المواد.
    2. انقل EBs العائمة (من الخطوة 1.1.14) إلى الأطباق المطلية (~ 50 EBs/طبق) باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر تحت مجهر مجسمة بتكبير 4x ووضعها في خزانة تدفق رقائقي.
      ملاحظه: من الأهمية بمكان اختيار EBs متجانسة ومتوسطة الحجم (قطرها ~ 200-300 ميكرومتر). قد لا تعيش EBs الصغيرة جدا بشكل جيد أثناء تمايز الأديم الظاهر العصبي ، بينما تميل EBs الكبيرة جدا إلى الخضوع لنخر الأساسي.
    3. احتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    4. في اليوم التالي (اليوم 3) ، افحص الأطباق تحت المجهر بتكبير 10 أضعاف للتأكد من أن EBs متصلة جميعا.
    5. قم بإجراء تغيير متوسط كلي برفق باستخدام وسيط NRI كامل.
    6. قم بتغيير وسط NRI كل يومين حتى اليوم 7 ، عندما تكون المجاميع الظهارية العصبية (الوريدات) مرئية.
    7. في اليوم 7 ، قم بتغطية المصفوفة القياسية (أو اللامينين) ، كما هو موضح في الخطوة 1.2 ، على أي شكل مطلوب من الطبق أو الطبق: ألواح 96 بئرا (100 ميكرولتر / بئر) ، ألواح 24 بئرا (250 ميكرولتر / بئر) ، ألواح 12 بئرا (500 ميكرولتر / بئر) ، رقائق MEA (للنشاط الكهربائي ، 1 مل / شريحة بئر واحدة) ، أو أطباق بتري 60 مم (4 مل / طبق).
    8. احتضان الأطباق / الأطباق المطلية لمدة ساعتين على الأقل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  4. تفكك الوردة والتمايز العصبي (أيام 8 → 28) < br / > ملاحظة: يتطلب هذا الإجراء مهارات يدوية جيدة ودقة. لتجنب جمع خلايا الأديم المتوسط والأديم الباطن ، يجب فصل وجمع الهياكل الشبيهة بالوردة الظاهرة فقط.
    1. في اليوم الثامن ، قم بتقطيع الهياكل الشبيهة بالوردة إلى شظايا تحت مجهر مجسمة بتكبير 10 أضعاف في ظروف معقمة. استخدم حقنة سعة 1 مل بإبرة 30 جرام. لاحظ أن الوريدات تميل إلى الانفصال عن الطبق عند لمسها بالإبرة بسهولة.
    2. أكمل فصل شظايا الوردة باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر.
    3. انقل الطبق أسفل غطاء التدفق الرقائقي واجمع شظايا الوردة ووسطها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام ماصة 1 أو 2 أو 5 مل. اشطف الطبق ب 2 مل من وسط NRI لاستعادة جميع الشظايا.
    4. قم بتدوير شظايا الوردة عند 112 × جم لمدة دقيقتين.
    5. شفط المادة الطافية.
    6. أعد تعليق الحبيبات برفق في 1 مل من 1x DPBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) وقم بربط شظايا الوردة برفق لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 1,000 ميكرولتر لفصلها جزئيا.
    7. أضف 4 مل من وسط NRI الكامل واحسب الخلايا باستخدام تريبان الأزرق وعداد الخلايا الآلي (انظر جدول المواد)
      ملاحظه: تمييع 20 ميكرولتر من تعليق الخلية في 20 ميكرولتر من التربان الأزرق. قد يتم حذف هذه الخطوة إذا تعذر إحضار الخلايا إلى معلق أحادي الخلية. إذا كانت شظايا الوردة لا تبدو منفصلة تماما ، فيمكن إعادة تعليق شظايا الوردة المشتقة من حوالي 50 EBs / 60 مم في 50 مل من وسط NRI الكامل ومطلية ، كما هو موضح في الجدول 1.
    8. استنشق محلول طلاء المصفوفة القياسية (أو اللامينين) من أطباق بتري و/أو الألواح و/أو رقائق الميتروجين (من الخطوة 1.3.7). لا تدعهم يجفوا.
    9. ضع الخلايا في وسط NRI كامل وفقا لخطة الدراسة (حوالي 15,000 خلية / سم2 ؛ انظر الجدول 1 للحصول على مؤشرات حجم الطلاء).
    10. احتضان الألواح طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    11. في اليوم العاشر ، قم بإجراء تغيير متوسط كلي باستخدام وسيط تمايز عصبي كامل (ND) ؛ انظر جدول المواد.
    12. قم بتحديث وسط ND الكامل مرتين في الأسبوع حتى اليوم 28.
< p class = "jove_content" >الجدول 1.

ملاحظة حول كثافة طلاء الوردة المنفصلة: إذا كانت شظايا الوردة لا تبدو منفصلة تماما ، من أجل الوصول إلى كثافة طلاء خلية تبلغ حوالي 15.000 خلية / سم 2 ، يمكن إعادة تعليق شظايا الوردة المنفصلة المشتقة من حوالي 50 EBs / 1 × 60 مم في 50 مل من وسط NRI الكامل وطلاءها على النحو التالي (اعتمادا على تنسيق اللوحة):

لوحات متعددة الآبار / MEA منطقة النمو (سم 2 / بئر) حجم تعليق الخلية إلى لوحة لكل بئر (أو شريحة MEA) الحد الأقصى لعدد الألواح التي يمكن طلاؤها (مع 50 مل من تعليق الخلية) 96 بئر 0.3 100 أولتر 5 48 بئر 0.7 220 ميكرولتر 4 24 بئرا 2 625 ميكرولتر 3 12 بئر 4 1.25 مل 3 6 آبار 10 3.125 مل 2 شريحة MEA بئر واحد 3.5 1.1 مل 45

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لبروتوكول التمايز العصبي. (الجزء العلوي) يمكن تقطيع مستعمرات IMR90-hiPSC إلى أجزاء لتشكيل أجسام جنينية (EBs). بعد يومين في المختبر (DIV) ، يمكن طلاء EBs على أطباق مغلفة بالمصفوفة أو القياسية وزراعتها في وجود وسيط الحث الظهاري العصبي (NRI) لتوليد مشتقات الأديم العصبي (وريدات ، ملطخة هنا ل nestin (أخضر) و β-III-tubulin (أحمر)). يمكن فصل الوريدات وجمعها وإعا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات hiPSC EB متوسط: خروج المغلوب DMEM ثيرمو فيشر 10829-018 (الخطوة 2.1.7) استبدال مصل الضربة القاضية (KOSR) ثيرمو فيشر هاتف: 10828-028 تركيز نهائي 20٪ (الخطوة 2.1.7) الأحماض الأمينية غير الأساسية ثيرمو فيشر 11140-035 (الخطوة 2.1.7) البنسلين / الستربتومايسين ثيرمو فيشر 15140-122 50 U / مل التركيز النهائي (الخطوة 2.1.7) محلول L-Glutamine 200 ملي ثيرمو فيشر هاتف: 25030-081 التركيز النهائي 2 ملي مولار (الخطوة 2.1.7) β ميركابتو إيثانول ثيرمو فيشر 31350-010 التركيز النهائي 50 ميكرومتر (الخطوة 2.1.7) وسط الحث الظهاري العصبي الكامل (NRI): DMEM / F12 ثيرمو فيشر 3133-038 (الخطوة 2.3.1) الأحماض الأمينية غير الأساسية ثيرمو فيشر 11140-035 (الخطوة 2.3.1) ملحق N2 ثيرمو فيشر 17502-048 (الخطوة 2.3.1) البنسلين / الستربتومايسين ثيرمو فيشر 15140-122 50 وحدة / مل التركيز النهائي (الخطوة 2.3.1) الهيبارين الصف I-A ، ≥180 وحدة USP / ملغ سيجما ألدريتش H3149-100KU 2 ميكروغرام/مل التركيز النهائي (الخطوة 2-3-1) bFGF ثيرمو فيشر 13256-029 يضاف التركيز النهائي 20 نانوغرام/مل قبل الاستخدام (الخطوة 2.3.1) ماتريجل مصفوفة الغشاء القاعدي كورنينج 354234 1:100 (الخطوة 2.2). قم بإذابة Matrigel على الثلج ، وقم بإعداد 200 ul aliquots وتخزينها في -80 درجة مئوية. للطلاء ، قم بتخفيف 200 ul aliquot في 20 مل من وسط DMEM / F12 البارد. لامينين سيجما ألدريتش L2020 1:100 (الخطوة 2.2). تمييع في PBS 1X. وسيط التمايز العصبي الكامل (ND): الوسط العصبي القاعدي ثيرمو فيشر 21103049 (الخطوة 2.4.11) مكملات B-27 (50x) ثيرمو فيشر 17504044 (الخطوة 2.4.11) ملحق N2 ثيرمو فيشر 17502-048 (الخطوة 2.4.11) البنسلين / الستربتومايسين ثيرمو فيشر 15140-122 التركيز النهائي 50 وحدة / مل (الخطوة 2.4.11) GDNF ثيرمو فيشر PHC7045 1 نانوغرام / مل التركيز النهائي. يضاف قبل الاستخدام. (الخطوة 2.4.11) BDNF ثيرمو فيشر PHC7074 2.5 نانوغرام / مل التركيز النهائي. يضاف قبل الاستخدام. (الخطوة 2.4.11)

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NRI

مقالات ذات صلة