تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. تفكك خلايا الدماغ المتوسط البطني
- انقل قطع الدماغ الأوسط البطني تحت غطاء التدفق الرقائقي. قم بإزالة محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) وأضف 1 مل دافئ مسبقا (37 درجة مئوية) 0.05٪ حمض التربسين - إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (تريبسين-EDTA) في الأنبوب المخروطي (أحجام تكفي لما يصل إلى 12 قطعة من الدماغ الأوسط البطني). احتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
- قم بإزالة التربسين EDTA تحت الغطاء وأضف 1 مل من وسط إلغاء التنشيط (سيعطل المصل التربسين) إلى الأنسجة.
- قم بإزالة وسط التعطيل واغسل المنديل في 1 مل من الوسط الكامل مرتين.
ملاحظه: لمنع التخلص من الخلايا المنفصلة ، تجنب إزالة كل الوسط من الأنبوب وسحب الأنسجة.
- أضف 1 مل من الوسط الكامل وقم بتقطيع المنديل بماصة زجاجية مصقولة بالنار. تجنب تكوين الفقاعات واستمر في التجربة حتى يتم تحقيق تعليق أحادي الخلية.
ملاحظة: عادة ، يلزم وجود 8-10 تمريرات عبر الطرف المقيد للتفكك الكامل.
- قم بالطرد المركزي للخلايا عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) وقم بإزالة الوسط.
- أعد تعليق الحبيبات في 1 مل وسط كامل عن طريق سحب العينة ببطء لأعلى ولأسفل حتى أربع مرات.
< p class = "jove_title" >
2. طلاء خلايا الدماغ الأوسط البطني
- امزج 10 ميكرولتر من معلق الخلية مع 90 ميكرولتر من محلول تريبان الأزرق واحسب عدد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
ملاحظه: يمكن أيضا التحقق من صلاحية الخلايا في هذه المرحلة.
- ضع أغطية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة في أطباق بتري مقاس 100 مم وانقل أغطية البولي إل أورنيثين / اللامينين المطلية ، باستخدام ملقط ، واحدة تلو الأخرى فوق الأغطية><.
ملاحظه: لا تغسل الغطاء وتجنب تجفيف اللامينين ، فقد يتسبب ذلك في عدم تكافؤ الثقافات ويقلل من بقاء الخلايا.
- اضبط مستوى الصوت على 1,500 خلية لكل 1 ميكرولتر عن طريق إضافة وسيط كامل و 100 ميكرولتر (إجمالي 150,000 خلية) من تعليق الخلية أعلى كل غطاء (الحجم هو الأمثل لتغطية سطح الغطاء دون انسكاب). أغلق أطباق بتري واحتضانها لمدة 1 ساعة في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون).
ملاحظه: خطوة حرجة: هذه الخطوة مطلوبة لتعزيز ارتباط الخلايا وقابليتها للحياة وزيادة عدد الغطاءات لكل جنين. بدلا من ذلك ، يمكن نقل الخلايا مباشرة إلى الآبار (التي تحتوي على أغطية) ، ولكن يجب زيادة عدد الخلايا إلى 350.000 لكل بئر (بدلا من 150.000). بمعنى آخر ، باستخدام هذه الطريقة ، يمكن الحصول على 8-10 أغطية ، بينما ينتج عن النقل المباشر حوالي 3-4 أغطية بسبب الخلايا التي تعلق على الألواح (بجانب أو تحتها الغطاء). كان متوسط جدوى الثقافات التي تستخدم هذه الطريقة حوالي 90٪.
< p class = "jove_title" >
3. نمو الثقافة وصيانتها
- بعد ساعة واحدة من الحضانة ، انقل الغطاء بعناية ، بما في ذلك الوسط ، إلى ألواح من 24 بئرا تحتوي على 400 ميكرولتر دافئ مسبقا (إلى 37 درجة مئوية) وسط كامل (الحجم الإجمالي: 500 ميكرولتر). احتضان الخلايا بين عشية وضحاها (O / N) عند 37 درجة مئوية.
- في غضون 24 ساعة بعد حضانة الآبار ، أضف برفق 500 ميكرولتر وسط كامل في كل بئر.
ملاحظة: الساعات القليلة الأولى هي المرحلة الأكثر أهمية لبقاء الخلايا العصبية الدوبامين ، ولا يتغير عدد الخلايا الباقية بشكل كبير بعد هذه النقطة.
- لا تضيف وسائط إضافية إلى المزارع خلال الأسبوعين الأولين أو حتى يصبح الوسط أصفر. إذا استغرقت لأكثر من أسبوعين أو تغير اللون المتوسط إلى اللون الأصفر ، فاستبدل نصف الوسائط (500 ميكرولتر) بوسائط جديدة وكاملة تم تسخينها مسبقا (عادة كل أسبوعين).
ملاحظه: الخلايا العصبية الدوبامين داخل الثقافات البقاء على قيد الحياة لأكثر من ستة أسابيع في ظل هذه الظروف.
