عزل الخلايا واستزراعها من الورم الدبقي البنطي الجوهري المنتشر

الملخص

المصدر: Lin، G.L. et al.، بروتوكول لزراعة الخلايا السريعة بعد الوفاة للورم الدبقي النبعي الداخلي المنتشر (DIPG).J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو عملية عزل وزراعة الخلايا السلفية الدبقية من الورم الدبقي الجسري الجوهري المنتشر ، أو أنسجة جذع الدماغ المصابة ب DIPG. يتم زراعة الخلايا الدبقية المعزولة من أنسجة الورم عن طريق الهضم الأنزيمي في وسط عصبي قاعدي ، مما يعزز نموها وتطور المجالات العصبية العائمة الحرة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. الحصول على عينات الأنسجة

ملاحظة: يتطلب أحد المكونات الحاسمة لهذا البروتوكول التعامل السليم مع التبرع بالأنسجة بدءا من وقت تشريح الجثة. تعتمد صلاحية العينة الإجمالية بشكل كبير على تقليل فترة ما بعد الوفاة (PMI) ، ونقل الأنسجة على الفور إلى الوسط البارد المناسب المكمل بالمضادات الحيوية / مضادات الفطريات ، والحفاظ على العينة على الثلج الرطب طوال فترة النقل ، والحفاظ على تقنية معقمة طوال البروتوكول.

1. عند الإخطار بالتبرع الوشيك ، قم بإعداد مجموعة أدوات جمع العينات. باستخدام صندوق شحن مع حاوية معزولة يمكن استخدامها مباشرة لنقل عينة الأنسجة ، قم بتضمين المواد التالية:
   1. قم بتضمين مواد للتحضير المعقم ، بما في ذلك القفازات المعقمة والستائر والمشارط.
   2. قم بتضمين 8-10 أنابيب مخروطية معقمة سعة 50 مل تحتوي على وسائط شحن سعة 30 مل في الحاوية المعزولة مع عبوات الثلج أو البرودة. < / > ملاحظه: في حين أن أي وسائط زراعة خلوية قياسية يمكن أن تعمل ، يتم الحصول على أفضل صلاحية للعينة باستخدام Hibernate-A المكمل بالمضادات الحيوية / مضادات الفطريات.
   3. قم بتضمين أي أنابيب عينة أخرى لتحليلات أخرى (مثل المثبتات).
   4. إذا لم يتم إجراء تشريح الجثة في موقع المحقق ، فقم بتضمين مستند يوضح بوضوح كيفية جمع عينة الورم. يتضمن ذلك تفاصيل مثل الحفاظ على العقم ، والاحتفاظ بأنابيب العينات على الجليد الرطب ، وتضمين عينات من الدماغ المتوسط والنخاع لأن الخلايا السرطانية غالبا ما تغزو هذه المناطق.
2. الحفاظ على العقم أثناء تشريح الجثة. ضع في اعتبارك أن الدماغ معقم داخل الجمجمة ، لذا راقب التقنية المعقمة (بما في ذلك تغيير القفازات) بمجرد فتح الجمجمة. تجنب التلوث بالجلد والشعر أمر بالغ الأهمية.
3. تشريح الورم من الجانب البطني ("بطن" الجسور ، انظر الشكل 1). باستخدام مشرط معقم ، قم بقطع قطع صغيرة بحجم 1 سم من الورم ونقلها على الفور إلى وسائط الشحن البارد (انظر الملاحظة في الخطوة 1.1.2) وضعها على الثلج الرطب. ضع 10 مل من الأنسجة في كل أنبوب ، مما ينتج عنه حجم نهائي من الأنسجة والوسائط في كل أنبوب يبلغ 40 مل.
   ملاحظه: في حالة الورم الدبقي الجسري الجوهري المنتشر (DIPG) ، يتسلل الورم بشكل منتشر إلى الجسر وغالبا ما يتسلل إلى بقية جذع الدماغ. على هذا النحو ، اجمع أكبر قدر ممكن من العينة ، بما في ذلك عادة 3-4 أنابيب (30-40 مل من الأنسجة) من الجسر و 1-2 أنبوب (10-20 مل من الأنسجة) من كل من الدماغ المتوسط والنخاع.
4. اجمع عينات من الدماغ المتوسط والنخاع جنبا إلى جنب مع الجسور ، والتي غالبا ما تحتوي على العديد من الخلايا السرطانية.
5. بعد جمع العينات ، قم بشحن العينات طوال الليل (O / N) على الثلج الرطب في الحاوية المعزولة. لا تشحن العينة على الثلج الجاف ، لأن التجميد سيقتل الخلايا.

< p class = "jove_title" >2. التحضير لمعالجة العينات

1. قبل البدء في تحضير العينة ، قم بتعقيم شفاطات زراعة الأنسجة جنبا إلى جنب مع شفرات الحلاقة ، ومرقئ الهيدومي المنحني ، وأي أدوات أخرى غير معقمة تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 1 ساعة. قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية في ظل ظروف معقمة لمنع تلوث الثقابات.
2. تحضير ومعقم محاليل الترشيح.
   1. لتحضير محلول سكروز 1.8 م ، قم بإذابة 308.07 جم من السكروز في 300 مل من الماء المقطر. أضف 50 مل 10x محلول ملحي مخزن من Hank (HBSS) بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم وارفع الحجم الإجمالي إلى 500 مل باستخدام الماء المقطر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   2. لتحضير محلول الهضم الأنزيمي ، خذ 50 مل HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم لكل 10 مل من الأنسجة المفرومة وأضف 500 ميكرولتر 5 مجم / مل منقوص الأكسجين ريبونوكلياز I (التركيز النهائي 50 ميكروغرام / مل) ، 500 ميكرولتر 2.5 مجم / مل من الكولاجيناز الأول / الثاني ومحلول متباين (التركيز النهائي 25 ميكروغرام / مل) ، و 500 ميكرولتر 1 م 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازيني إيثان سلفونيك حمض (HEPES). قم بتسخين محلول الهضم في حمام مائي 37 درجة مئوية.
   3. لتحضير قاعدة وسائط جذع الورم (TSM) ، اخلطي 250 مل من Neurobasal-A ، و 250 مل من Dulbecco's Modified Eagle Medium: خليط المغذيات F12 (DMEM / F12) ، و 5 مل 100x مضاد حيوي مضاد للفطريات ، و 5 مل 200 مل L-alanyl-L-glutamine ثنائي الببتيد (GlutaMAX-A) ، و 5 مل عازلة HEPES ، و 5 مل 100 ملي بيروفات الصوديوم ، و 5 مل 100x MEM من الأحماض الأمينية غير الأساسية.
   4. لتحضير TSM كامل مع عوامل النمو ، أضف المكملات التالية إلى قاعدة TSM: مكمل B27 50x ناقص فيتامين أ (1:50) ، عامل نمو البشرة البشري (H-EGF ، 20 نانوغرام / مل) ، عامل نمو الخلايا الليفية البشرية (H-FGF ، 20 نانوغرام / مل) ، عامل النمو البشري المشتق من الصفائح الدموية AA (H-PDGF-AA ، 10 نانوغرام / مل) ، عامل النمو البشري المشتق من الصفائح الدموية BB (H-PDGF-BB ، 10 نانوغرام / مل) ، ومحلول الهيبارين (2 ميكروغرام / مل).
3. قم بتبريد جهاز طرد مركزي مختبر مجهز بدوار دلو متأرجح إلى 4 درجات مئوية.

فئة

3. التفكك الميكانيكي

1. انقل الأنسجة إلى طبق ثقافة خلية عالي الجدران مقاس 100 مم × 20 مم. قم بإزالة الوسائط المتبقية من الشحن واستبدلها بوسائط استزراع بارد سعة 10-15 مل.
2. باستخدام المرقئ المنحني للإمساك بشفرة الحلاقة ، قم بفرم الأنسجة جيدا أثناء إزالة الأوعية الدموية أو السحايا الواضحة.
   ملاحظه: يجب أن تكون شظايا الأنسجة النهائية أصغر من 1 مم (انظر الشكل 2 ب).
3. انقل الأنسجة إلى أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 مل. اغسل طبق زراعة الخلايا بوسائط زراعة باردة إضافية سعة 5 مل وانقله إلى الأنبوب المخروطي. كرر خطوة الغسيل هذه حسب الضرورة لنقل الأنسجة المتبقية.
4. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، قم بترتيبات برفق (4-5 مرات). اسمح لشظايا الأنسجة الكبيرة بالاستقرار في قاع الأنبوب. إذا لزم الأمر ، قم بالطرد المركزي للعينة لفترة وجيزة لمدة دقيقة واحدة (350 × جم ، 4 درجات مئوية).
5. اجمع الكسر المنفصل ميكانيكيا.
   1. قم بإزالة المادة الطافية وقم بتصفيته من خلال مرشح 100 ميكرومتر إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل يسمى "التفكك الميكانيكي". اقلب المرشح فوق الأنبوب المخروطي الأصلي واغسله بوسط المزرعة لاستعادة شظايا الأنسجة.
   2. جهاز الطرد المركزي جزء "التفكك الميكانيكي" لمدة 5 دقائق (350 × جم ، 4 درجات مئوية).
   3. قم بإزالة المادة الطافية من جزء "التفكك الميكانيكي" المحبب وأعد تعليق الأنسجة في وسط الثقافة الباردة. إذا كان هناك أكثر من 5 مل من الأنسجة في الأنبوب المخروطي "التفكك الميكانيكي" ، فقم بتقسيم الأنسجة إلى أنابيب مخروطية أخرى سعة 50 مل بحيث لا يحتوي أي أنبوب على أكثر من 5 مل.
6. قم بتخزين الجزء المنفصل ميكانيكيا على الجليد حتى خطوة الطرد المركزي المتدرج للسكروز (الخطوة 5). بدلا من ذلك ، يمكن للكسر المنفصل ميكانيكيا الانتقال إلى الخطوة 5 خلال فترة حضانة التفكك الأنزيمي (الخطوة 4.4).

< p class = "jove_title" >4. التفكك الأنزيمي

1. إذا كان هناك أكثر من 5 مل من الأنسجة في الأنبوب الذي يحتوي على شظايا الأنسجة الكبيرة المتبقية ، فقم بتقسيم الأنسجة إلى أنابيب مخروطية جديدة أخرى سعة 50 مل بحيث لا يحتوي أي أنبوب على أكثر من 5 مل من الأنسجة.
2. جهاز الطرد المركزي للأنبوب (الأنبوب) المخروطي الذي يحتوي على شظايا الأنسجة المتبقية لمدة 5 دقائق (350 × جم ، 4 درجات مئوية).
3. قم بإزالة المادة الطافية وأضف محلول الهضم الأنزيمي الدافئ مسبقا ، بحيث يكون هناك محلول هضم 5 مل لكل 1 مل من الأنسجة (على سبيل المثال ، محلول هضم 25 مل ل 5 مل من الأنسجة).
4. أغلق أغطية الأنبوب المخروطية بغشاء مختبري واحتضان التفاعل على دوار عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
5. بعد الحضانة ، قم بترقيم العينات برفق (انظر الشكل 2 ج).
   1. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، قم بسحب العينة لأعلى ولأسفل 6-8 مرات. تجنب توليد فقاعات هواء مفرطة.
   2. أضف طرف ماصة سعة 1,000 ميكرولتر إلى نهاية الماصة وقم بترتيبات 6 - 8 مرات إضافية.
   3. اسمح لأي قطع متبقية بالاستقرار في قاع الأنبوب. قم بإزالة وتصفية المادة الطافية مع استمرار تعليق الخلايا من خلال مرشح 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل يسمى "التفكك الأنزيمي" وتخزينه على الجليد.
   4. إذا بقيت شظايا كبيرة من الأنسجة ، أضف 10 مل إضافي من HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم إلى الشظايا وكرر الخطوتين 3.5.1 و 3.5.2. قم بتصفية هذا المحلول النهائي من خلال مرشح 100 ميكرومتر في أنبوب "التفكك الأنزيمي".
6. جهاز الطرد المركزي لأنبوب "التفكك الأنزيمي" لمدة 5 دقائق (350 × جم ، 4 درجات مئوية) واستمر في الطرد المركزي المتدرج للسكروز.

فئة

5. الطرد المركزي المتدرج السكروز

1. إذا كانت العينات لا تزال معلقة في المحلول ، فإن جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق (350 × جم ، 4 درجات مئوية).
2. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الأنسجة في 20 مل HBSS بارد بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. يصل الحجم إلى 25 مل إجمالا مع HBSS البارد.
3. أضف ببطء 25 مل 1.8 م محلول سكروز واقلب الأنبوب للخلط. ينتج عن هذا تدرج السكروز 0.9 متر.
4. جهاز طرد مركزي بدون فرامل لمدة 10 دقائق (800 × جم ، 4 درجات مئوية). سيؤدي استخدام فرامل الطرد المركزي إلى تعطيل التدرج وتقليل العائد (انظر الشكل 2D للحصول على مثال لعينة قبل وبعد الطرد المركزي).
5. استنشق بعناية بقايا المايلين وأكبر قدر ممكن من محلول السكروز. اغسل العينة بإضافة 30 مل من HBSS البارد بدون الكالسيوم والمغنيسيوم والخلط برفق. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق (350 × جم ، 4 درجات مئوية).

فئة

6. تحلل خلايا الدم الحمراء ACK

1. قم بإزالة مادة الغسيل. أضف 5 مل من المخزن المؤقت لتحلل ACK وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق ، وقم بتدوير الأنبوب لمدة 1 دقيقة في RT.
2. قم بإخماد التحلل بإضافة 30 مل من HBSS البارد بدون الكالسيوم والمغنيسيوم.
3. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق (350 × جم ، 4 درجات مئوية).

7. صيانة الثقافة الأولية

1. أعد تعليق كريات الخلية النهائية في 10-15 مل TSM كامل دافئ مع عوامل النمو وحدد كثافة الخلايا القابلة للحياة على مقياسات الدم باستخدام استبعاد تريبان الأزرق.
   ملاحظه: يختلف نطاق الخلايا القابلة للحياة بشكل كبير اعتمادا على ظروف التبرع بالأنسجة ، وقد يكون القياس الكمي صعبا في هذه المرحلة المبكرة بسبب بقايا الحطام الخلوي. في الحالة المثالية، تهدف إلى الحصول على مليون خلية حية لكل عينة. في الحالات التي يظل فيها الحطام المفرط ، يتم وضع صفيحة بكثافة أقل في قارورة T175.
2. انقل معلقات الخلية النهائية إلى قارورة ثقافة T75 جديدة. ارتفاع في عوامل النمو الإضافية كل يومين للحفاظ على مستويات عامل النمو الإجمالية ومراقبة تطور الخلايا العصبية للخلايا السرطانية (انظر الشكل 2E والشكل 3).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. عينة تشريح جثة ورم بونتين. الظهور الفوري بعد الوفاة للورم الدبقي الجسري الجوهري المنتشر. يظهر الورم على شكل كتلة كبيرة غنية بالمايلين على السطح البطني للجسور.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 2. عينات الأنسجة في مراحل مختلفة من المعالجة. (...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات السبات أ جيبكو أ12475-01 HBSS مع الكالسيوم / المغنيسيوم جيبكو 24020-117 HBSS كورنينج 21-022-السيرة الذاتية هيبس جيبكو هاتف: 15630-080 Liberase DH (كولاجيناز / Dispase) روش 5401054001 الحمض النووي الأول ورثينجتون بيوكيمياء LS002007 سكروز سيغما S0389 مضاد حيوي / مضاد للفطريات جيبكو هاتف: 15240-096 عصبي - أ جيبكو 10888-022 DMEM / F12 جيبكو 11330-032 جلوتا ماكس آي (100X) جيبكو 35050-061 بيروفات الصوديوم (100 ملم) جيبكو هاتف: 11360-070 مكمل فيتامين ب 27 ناقص فيتامين أ جيبكو هاتف: 12587-010 الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100X) جيبكو 11140-050 PDGF-AA البشري شيناندواه التكنولوجيا الحيوية 100-16 PDGF-BB البشري شيناندواه التكنولوجيا الحيوية 100-18 EGF البشري شيناندواه التكنولوجيا الحيوية 100-26 FGF البشري شيناندواه التكنولوجيا الحيوية 100-146 شفرات مشرط معقمة بارد باكر 372610 مرقئ منحني أدوات العلوم الدقيقة 13013-14 شفرات الحلاقه VWR 55411-050 طبق ثقافة خلية 100 × 20 مم كورنينج 353003 ملقط معقم TWD Tradewinds DF8988-5 ستائر معقمة 3 م 2037 قفازات معقمة كيمبرلي كلارك 1182307 عازلة تحلل ACK جيبكو A1049201 مرشح شبكة 100 ميكرون صياد هاتف: 352360 50 مل أنبوب مخروطي صياد 1495949 أ