تمايز الخلايا السلفية العصبية للحبل الشوكي إلى خلايا عصبية حركية

الملخص

المصدر: Taga، A. et al.، إنشاء منصة فيزيولوجية كهربية لنمذجة التصلب الجانبي الضموري مع الخلايا النجمية والخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ذات الاحتياجات الإقليمية. ج. فيس. إكسب. (2021).

يعرض هذا الفيديو طريقة لتمييز الخلايا السلفية العصبية للحبل الشوكي (NPCs) إلى خلايا عصبية حركية. إنه يفصل عملية استزراع الشخصيات غير القابلة للعب على صفيحة ثقافة مغلفة باستخدام وسائط متخصصة غنية بمثبطات محددة تهدف إلى تسهيل تمايز NPC إلى خلايا عصبية حركية ناضجة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. ذوبان ثقافات الخلايا السلفية العصبية (NPC)

1. قم بتغطية ألواح 10 سم بالبولي أورنيثين (PLO) واللامينين في اليوم السابق لإذابة الخلايا.
   1. أضف 5 مل من PLO المخفف إلى 100 ميكروغرام / مل في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أو الماء المقطر (dH₂O) إلى الألواح. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة حتى الليل.
   2. قم بشفط محلول PLO وشطف الألواح ثلاث مرات باستخدام PBS. (منظمة التحرير الفلسطينية سامة إذا لم يتم غسلها بشكل صحيح.)
   3. أضف اللامينين المخفف في PBS إلى تركيز 10 ميكروغرام / مل إلى الألواح المطلية ب PLO. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل ، ويفضل بين عشية وضحاها. بعد الحضانة ، قم بشفط محلول اللامينين دون شطفه لتعزيز التصاق الخلايا.
      ملاحظه: يمكن طلاء الألواح ب PLO في وقت مبكر ، وغسلها ثلاث مرات بالماء ، وتجفيفها في غطاء معقم ، وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
2. قم بإذابة قارورة واحدة من NPC تحتوي على 6 × 10⁶ خلايا / قارورة لكل صفيحة زراعة خلايا مقاس 10 سم.
3. قم بإزالة أنبوب التبريد NPC من النيتروجين السائل وضعه على الفور في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى دقيقتين. قم بإذابة الثلج بسرعة عن طريق هز القارورة حتى تكون هناك قطعة ثلج صغيرة محاطة بالسائل.
4. تنقل الخلايا المجمعة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر وأضف ما يصل إلى 15 مل من وسط التمايز العصبي الدافئ مسبقا (NDM) أو مكمل Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) / Ham's F21 F12 لتخفيف ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
5. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
6. قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية بوسط تمايز الخلايا العصبية الحركية (MN) (الجدول 1) + ROCK-I (20 ميكرومتر) ، واستخدم ماصة 1000 ميكرولتر للثلاثية لأعلى ولأسفل حتى يتم الحصول على تعليق خلية واحدة (حتى 5 مرات).
7. انقل المعلق أحادي الخلية إلى صفيحة مطلية ب PLO-Laminin مقاس 10 سم.
8. انقل اللوحة إلى حاضنة واتركها دون إزعاج طوال الليل للسماح بالالتصاق الخلوي بشكل صحيح

< p class = "jove_title" >2. تمييز NPC في الحبل الشوكي إلى خلايا عصبية حركية

1. قم بتنفيذ الخطوات الأولية كما هو مذكور في الخطوات 1.1-1.8 ، مع كون الوسيط النهائي هو وسط تمايز MN + ROCK-I (20 ميكرومتر).
2. في اليوم التالي للطلاء ، قم بإجراء تبادل كامل للوسيط باستخدام وسيط تمايز MN بدون ROCK-I ، ثم قم بتغيير الوسائط كل يومين. خلال عطلة نهاية الأسبوع ، قم بإطعام الخلايا يوم الجمعة ثم مرة أخرى يوم الاثنين. اشطف الخلايا باستخدام PBS عند الحاجة لإزالة بقايا الخلايا.
3. قم بتغيير الوسط باستخدام وسط تمايز MN + السيتوزين أرابينوسيد (ARA-C) (0.02 ميكرومتر) واحتضانه لمدة 48 ساعة عندما تظهر الأسلاف الملتزمة بالدبق كخلايا مسطحة مفردة تتكاثر تحت أسلاف MN بعد الانقسام المجمعة في مجموعات الخلايا.
   ملاحظه: عادة ، يحدث هذا خلال أول 7 أيام بعد الطلاء الأولي ، على الرغم من أنه قد يكون هناك تباين اعتمادا على خط الخلية.
4. بعد 48 ساعة ، قم بشفط الوسط الذي يحتوي على ARA-C ، واشطف المزرعات برفق باستخدام PBS ثلاث مرات ، وقم بتغيير وسط MN المتوسط إلى الطازج بدون ARA-C.
5. بعد العلاج باستخدام ARA-C ، قم بإجراء عمليات تبادل متوسطة كل يومين (أو الاثنين والأربعاء والجمعة) عن طريق إزالة الوسط القديم بماصة يدوية بدلا من شفاط فراغ لمنع الانفصال المبكر للعناقيد العصبية. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإثراء وسط MN ب Laminin 1 ميكروغرام / مل مرة واحدة في الأسبوع لتعزيز ارتباط الخلايا العصبية بألواح الثقافة.

الجدول 1: الثقافة الإعلامية

اسم متوسط الكواشف تركيزات وسط التمايز العصبي (NDM) Neurobasal
L-الجلوتامين
الأحماض الأمينية غير الأساسية
الملحق N - ملحق N2
البنسلين / الستربتومايسين 1x
100x
100x
100x
100 ضعف وسط تمايز الخلايا العصبية الحركية وسيط التمايز العصبي
حمض الأسكوربيك
بورومورفامين < br / > عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ
عامل التغذية العصبية الهدفي
عامل النمو الشبيه بالأنسولين 1
عامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية
حمض الريتينويك
المجمع E
الملحق ب - مكمل B27 1x
0.4 ميكروغرام / مل < br / > 1 ميكرومتر < br / > 10 نانوغرام / مل < br / > 10 نانوغرام / مل < br / > 10 نانوغرام / مل < br / > 10 نانوغرام / مل < br / > 1 ميكرومتر < br / > 125 نانومتر
50 ضعفا

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ألواح ثقافة معقمة 10 سم صقر 353003 الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) ثيرموفيشر 11140050 تركيز العمل 100x ملحق N - ملحق N2 ثيرموفيشر 17502048 تركيز العمل 100x ل-جلوتامين ثيرموفيشر هاتف 25030 تركيز العمل 100x العصبي العصبي ثيرموفيشر 21103049 تركيز العمل 1x حمض الريتينويك (RA) سيغما R2625 قم بإذابة 100 مجم في 3.3 مل من DMSO للحصول على محلول مخزون 100 ملم. Aliquot المخزون 100 ميكرولتر / أنبوب وتجميد عند -80 درجة مئوية. خذ 200 ميكرولتر من مخزون 100 ملي وقم بتخفيف 10x (أضف 1.8 مل من DMSO) لعمل 10 ملي من المخزون. Aliquot 50 ميكرولتر / أنبوب وتخزينه في -80 درجة مئوية. تمييع في 1: 10000 للاستخدام. (تركيز العمل 2 ميكرومتر). بولي أورنيثين (منظمة التحرير الفلسطينية) سيجما ألدريتش ص 3655 قم بإذابة 100 مجم في 1 مل من ddW للحصول على محلول مخزون 100 مجم / مل. Aliquot المخزون في أنابيب 100 ميكرولتر. (تركيز العمل 100 ميكروغرام / مل) لامينين ثيرموفيشر 23017-015 محلول المخزون 1 مجم / مل ، تركيز العمل 10 ميكروغرام / مل (طلاء) ، 1 ميكروغرام / مل (وسائط الخلية) حمض الأسكوربيك (ASAC) سيغما أ 4403 قم بإذابة 100 مجم في 250 مل من dH2O للحصول على 0.4 مجم / مل من المرق. مرشح معقم من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر ، وتناول الطعام والتجميد عند -80 درجة مئوية. (تركيز العمل 0.4 ميكروغرام / مل). عامل التغذية العصبية الدردبية (CNTF) بيبروتك 450-13 قم بإذابة 100 ميكروغرام في 1 مل من PBS المعقم ، ثم أضف 9 مل من BSA-PBS المعقم 0.1٪ إلى 10 ميكروغرام / مل. Aliquot وتجميد عند -80 درجة مئوية. خفف عند 1: 1000 للاستخدام. (تركيز العمل 10 نانوغرام / مل). المجمع E أبكام أب142164 قم بإذابة 250 ميكروغرام في 2.0387 مل من DMSO للحصول على مخزون 250 ميكرومتر. Aliquot والتجميد عند -80 درجة مئوية. خفف 1: 2000 للاستخدام. (تركيز العمل 125 نانومتر). DMEM / F12 ثيرموفيشر هاتف: 113300 تركيز العمل 1x التغذية العصبية المشتقة من خط الخلايا الدبقية (GDNF) بيبروتك 450-10 قم بإذابة 100 ميكروغرام في 1 مل من PBS إلى 100 ميكروغرام / مل ، ثم أضف 9 مل من BSA-PBS المعقم 0.1٪ إلى 10 ميكروغرام / مل. Aliquot وتجميد عند -80 درجة مئوية. خفف عند 1: 1000 للاستخدام. (تركيز العمل 10 نانوغرام / مل). مثبط ROCK-I بيبروتك 1293823 قم بإذابة 5 مجم في 1480 ميكرولتر من dH2O للحصول على مخزون 10 ملي مولار ، وحصة وتجميدها عند -80 درجة مئوية. (تركيز العمل 20 ميكرومتر). بينسلين / ستربتومايسين ثيرموفيشر 15140122 تركيز العمل 100x بورمورفامين (PMN) ميليبور سيجما 540223 قم بإذابة 5 مجم في 9.6 مل من DMSO للحصول على محلول 1 ملم. Aliquot والتجميد عند -80 درجة مئوية. تمييع 1: 1000 للاستخدام. (تركيز العمل 1 ميكرومتر). عامل التغذية العصبية المؤتلف المشتق من الإنسان والدماغ (BDNF) بيبروتك 450-02 جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة قبل إعادة التشكيل. قم بإذابة 100 ميكروغرام في 1 مل من PBS إلى 100 ميكروغرام / مل ، ثم أضف 9 مل من BSA-PBS المعقم 0.1٪ إلى 10 ميكروغرام / مل. Aliquot وتجميد عند -80 درجة مئوية. خفف عند 1: 1000 للاستخدام. (تركيز العمل 10 نانوغرام / مل). عامل النمو الشبيه بالأنسولين 1 (منتدى إدارة الإنترنت-1) أنظمة البحث والتطوير 291-G1-200 قم بإذابة 200 ميكروغرام في 2 مل من PBS إلى 100 ميكروغرام / مل ، ثم أضف 18 مل من 0.1٪ BSA-PBS لعمل 10 ميكروغرام / مل من المرق وتخزينه عند -80 درجة مئوية. (تركيز العمل 10 نانوغرام / مل). التغذية العصبية المشتقة من خط الخلايا الدبقية (GDNF) بيبروتك 450-10 قم بإذابة 100 ميكروغرام في 1 مل من PBS إلى 100 ميكروغرام / مل ، ثم أضف 9 مل من BSA-PBS المعقم 0.1٪ إلى 10 ميكروغرام / مل. Aliquot وتجميد عند -80 درجة مئوية. خفف عند 1: 1000 للاستخدام. (تركيز العمل 10 نانوغرام / مل). حمض الريتينويك (RA) سيغما R2625 قم بإذابة 100 مجم في 3.3 مل من DMSO للحصول على محلول مخزون 100 ملم. Aliquot المخزون 100 ميكرولتر / أنبوب وتجميد عند -80 درجة مئوية. خذ 200 ميكرولتر من مخزون 100 ملي وقم بتخفيف 10x (أضف 1.8 مل من DMSO) لعمل 10 ملي من المخزون. Aliquot 50 ميكرولتر / أنبوب وتخزينه في -80 درجة مئوية. تمييع في 1: 10000 للاستخدام. (تركيز العمل 2 ميكرومتر). المجمع E أبكام أب142164 قم بإذابة 250 ميكروغرام في 2.0387 مل من DMSO للحصول على مخزون 250 ميكرومتر. Aliquot والتجميد عند -80 درجة مئوية. خفف 1: 2000 للاستخدام. (تركيز العمل 125 نانومتر). الملحق ب - مكمل B27 ثيرموفيشر 21985023 تركيز العمل 50x أغطية زراعة الخلايا المعقمة شركة بيكر SG-600 جهاز طرد مركزي لثقافة الخلايا على الطاولة ثيرموفيشر 75004261 سورفال ليجند X1R حمام مائي ثيرموفيشر 2332 ريال إيزوتيمب حاضنة زراعة الخلايا التي يتم التحكم فيها بالرطوبة ثيرموفيشر 370 دولار ضبط على 37 درجة مئوية, 5٪ CO2