عزل واستزراع أسلاف الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية الفئران

الملخص

المصدر: Bovio ، P. ، et al. ، عزل وزراعة الأسلاف العصبية متبوعا بالكروماتين المناعي لعلامة هيستون 3 ليسين 79 ثنائي ميثيل. (2018)

يوضح هذا الفيديو عزل وزراعة الخلايا السلفية العصبية المخيخية من مخيخ جرو الفأر. يتم عزل أسلاف الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية وتنقيتها من خلال الالتصاق التفاضلي ، مما يؤدي إلى إزالة الخلايا النجمية بشكل فعال. تتمايز هذه الأسلاف المستنبتة لاحقا إلى خلايا عصبية حبيبية مخيخية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. الاستعدادات

1. الاستعدادات لعزل CGNP (سلف الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية)
   1. قم بتنظيم تزاوج مناسب للفئران لتوليد P5-P7 لعزل المخيخ (3-5 لكل ChIP وحالة).
   2. تحضير HBSS / الجلوكوز عن طريق إضافة 6 مجم / مل من الجلوكوز إلى المخزن المؤقت HBSS.
   3. تحضير وسط زراعة الخلايا CGNP (CGM) عن طريق إضافة 1٪ (حجم / حجم) مكمل N2 ، 1٪ (حجم / حجم) بنسلين - ستربتومايسين - نيومايسين ، 25 ملي مولار KCl و 10٪ FCS إلى DMEM-F12. لزراعة CGNP ، قم بإعداد وسط CGM بدون FCS ولكن بما في ذلك 0.6 ميكروغرام / مل قنفذ صوتي (SHH) (CGM-SHH) وقم بموازنته إلى 37 درجة مئوية عند الحاجة.
   4. قم بتغطية ألواح زراعة الخلايا المكونة من 6 آبار ب 100 ميكروغرام / مل بولي دي ليسين لمدة 1-2 ساعة في RT لإزالة الخلايا الدبقية. بعد ذلك ، اغسل مرتين باستخدام ddH₂O معقم واترك الأطباق تجف. قم بتخزين الأطباق لمدة أسبوع واحد كحد أقصى عند 4 درجات مئوية.
   5. لزراعة CGNPs ، قم بتغطية ألواح زراعة الخلايا المكونة من 6 آبار ب poly-L-ornithine (0.1 مجم / مل) عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. بعد ذلك ، اغسل مرتين باستخدام H₂O لزراعة الخلايا واترك الأطباق تجف.
      ملاحظه: يمكن تخزين الأطباق لمدة أسبوع واحد كحد أقصى عند 4 درجات مئوية.
   6. تحضير 0.025٪ تريبسين (وزن / حجم) في HBSS / الجلوكوز وموازنته إلى 37 درجة مئوية عند الحاجة.
2. عزل السلف العصبي لأنسجة المخ
   1. عزل وزراعة اختيارية ل CGNPs (أسلاف الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية)
      1. قتل P5-7 عن طريق قطع الرأس باستخدام المقص. قم بإزالة جلد فروة الرأس وافتح الجمجمة وإزالة الدماغ باستخدام مقص صغير وملقط. عزل المخيخ ونقله إلى HBSS / الجلوكوز المثلج. قم بإزالة جميع السحايا والأوعية الدموية ونقل المخيخ إلى أنابيب سعة 15 مل مملوءة ب HBSS / الجلوكوز البارد.
      2. اغسل المخيخ ثلاث مرات باستخدام 10 مل HBSS / Glucose المثلج (اجمعها عن طريق الطرد المركزي عند 650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية) وقم بتجانس المخيخ لاحقا عن طريق سحب المخيخ برفق لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 1 مل (بحد أقصى 2-3 مرات) للحصول على 0.5-1 مم³ شظايا.
      3. أضف 5 مل من 0.025٪ تريبسين في HBSS / الجلوكوز واحتضان الأنسجة تحت التحريك المستمر في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      4. قم بإزالة المادة الطافية وقم بتقطيع الأنسجة بطرف ماصة سعة 1 مل في 1 مل من CGM ونقلها إلى أنبوب جديد سعة 15 مل.
         ملاحظه: من المهم تجنب فقاعات الهواء.
         1. أضف 5 مل من CGM واحتضن الخليط لمدة دقيقتين على الثلج لتسوية بقايا الأنسجة. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 15 مل. أضف 2 مل من CGM إلى الأنسجة المتبقية وكرر إجراء المعالجة.
      5. قم بتجميع المواد الطافية (بدون بقايا الأنسجة ، حوالي 10 مل في المجموع) وأجهزة الطرد المركزي عند 650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لجمع الخلايا المخيخية. أعد تعليق الحبيبات في 10 مل CGM.
      6. نظرا لأن الخلايا النجمية تلتصق بشكل أسرع وأقوى ب poly-D-lysine من CGNPs ، قم بوضع الخلايا على 100 ميكروغرام / مل من 6 ألواح بئر مطلية ب poly-D-lysine (حتى 4 مل لكل بئر) واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية لإزالة الخلايا النجمية.
      7. رج الطبق واجمع المادة الطافية. ثم جهاز الطرد المركزي عند 650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية في أنبوب 15 مل. أعد تعليق الحبيبات في 10 مل CGM وعد الخلايا بغرفة عد Neubauer.
         ملاحظه: CGNPs مستديرة وصغيرة وتظهر هالة عند تصويرها باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور.
      8. إذا لزم الأمر ، قم بزرع الخلايا في 37 درجة مئوية CGM الدافئ مسبقا على ألواح مطلية ب poly-L-ornithine (3 × 10⁶ خلايا لكل 6 بئر) واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ و 100٪ رطوبة نسبية.
         ملاحظه: سيؤدي ترك CGM على الألواح (ومع FBS) إلى تمايز CGNPs إلى خلايا عصبية حبيبية مخيخية (CGNs).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مكمل B27 (50x) تقنيات الحياة 17504044 التصنيف: زراعة الخلايا
اختصار/تعليق: ل CCM DMEM-F12 تقنيات الحياة هاتف: 11320-033 التصنيف: زراعة الخلايا
اختصار / تعليق: ل CGM مصل الأبقار الجنيني 10٪ (حجم / حجم) جيبكو 10082147 التصنيف: زراعة الخلايا
اختصار / تعليق: لعزل التكلفة المزروعة للنقرة و CGM الجلوكوز سيجما ألدريتش جي 5767 التصنيف: زراعة الخلايا
اختصار/تعليق: لعزل CGNP الجلوتاثيون (1.25 مجم / مل) سيجما ألدريتش جي 4251 التصنيف: زراعة الخلايا
اختصار/تعليق: ل CCM جلايسين كارل روث 3187 التصنيف: تشيب < / > اختصار / تعليق: لتثبيت الخلية محلول الملح المتوازن من هانك تقنيات الحياة 14025-100 التصنيف: زراعة الخلايا
اختصار / تعليق: HBSS L-جلوتامين (200 ملم) تقنيات الحياة 25030081 التصنيف: زراعة الخلايا
اختصار/تعليق: ل CCM لامينين سيجما ألدريتش L2020 التصنيف: زراعة الخلايا
اختصار / تعليق: لثقافة التصنيف التعاوني للبراءات مكمل N2 تقنيات الحياة 17502048 التصنيف: زراعة الخلايا
اختصار / تعليق: ل CGM الوسط العصبي القاعدي جيبكو 21103049 التصنيف: زراعة الخلايا
اختصار/تعليق: ل CCM البنسلين - الستربتومايسين - نيومايسين 1٪ (حجم / حجم) تقنيات الحياة 15640055 التصنيف: زراعة الخلايا
الاختصار/التعليق: PSN، ل CCM و CGM محلول ملحي مخزن بالفوسفات تقنيات الحياة 10010023 التصنيف: زراعة الخلايا
اختصار/تعليق: PBS، لعزل CPC بولي دي ليسين سيجما ألدريتش ص 6407 التصنيف: زراعة الخلايا
اختصار/تعليق: لعزل CGNP بولي إل أورنيثين هيدروبروميد سيجما ألدريتش ص 3655 التصنيف: زراعة الخلايا
اختصار / تعليق: لثقافة التصنيف التعاوني للبراءات كلوريد البوتاسيوم ثيرمو فيشر AM9640G التصنيف: زراعة الخلايا
اختصار / تعليق: KCl ، ل CGM القنفذ الصوتي (SHH) سيجما ألدريتش SRP6004 التصنيف: زراعة الخلايا
اختصار/تعليق: لعزل CGNP ديسموتاز فائق الأكسيد (1 مجم / مل) سيجما ألدريتش إس 7571 التصنيف: زراعة الخلايا
اختصار/تعليق: ل CCM التربسين EDTA 0,05٪ (وزن / حجم) سيجما ألدريتش 59417ج التصنيف: زراعة الخلايا
الاختصار/التعليق: لعزل التكلفة المعرضة للبراءات