توليد الكرات من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

الملخص

المصدر: Shaker، M.R.، et al. جيل قوي وقابل للتكرار بدرجة كبيرة من عضيات الدماغ القشرية لنمذجة الشيخوخة العصبية في الدماغ في المختبر.

يوضح هذا الفيديو تحول الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) إلى عضيات دماغية كروية. باستخدام مثبطات محددة ، يتم توجيه hPSCs للتمايز نحو سلالة عصبية ، وتشكيل مستعمرات الأديم العصبي. ثم يتم إدخال عوامل نمو خاصة ، والتي تشجع التنظيم الذاتي وانتشار المستعمرات ، مما يؤدي في النهاية إلى تكوين عضيات كروية في الدماغ.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. توليد العضوية القشرية في الدماغ (الشكل 1)

ملاحظة: ستحدث جميع الخطوات الواردة في هذا القسم من البروتوكول في غطاء السلامة البيولوجية من الفئة 2 ما لم ينص على خلاف ذلك.

1. تحريض مستعمرات الأديم العصبي الظاهر ثنائي الأبعاد من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) مزرعة ثنائية الأبعاد (أيام -1 إلى 3)
   1. قبل الحث ، قم بوضع مستعمرات hPSC على مصفوفة غشاء القاعد المؤهلة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) في صفيحة مكونة من 6 آبار بكثافة 20٪ -30٪. حقق هذه الكثافة عن طريق تمرير مستعمرات hPSC من بئر واحد من صفيحة مكونة من 6 آبار عند التقاء 60٪ إلى ثلاثة آبار من صفيحة مكونة من 6 آبار.
   2. لطلاء مصفوفة الغشاء القاعدي ، قم بتخفيف مصفوفة الغشاء القاعدي بنسبة 1:50 في وسط قاعدي عادي. قم بإيداع 1 مل / بئر بالتساوي من صفيحة مكونة من 6 آبار ، واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT) ، ثم استنشقها.
   3. الحفاظ على مستعمرات hPSC لمدة يوم واحد في 2 مل من وسط زراعة الخلايا الخالي من المصل قبل التمايز.
   4. في يوم تمايز hPSC ، افحص مستعمرات hPSC باستخدام الفحص المجهري الساطع بمعدل تكبير 4x إلى 10x لضمان مستعمرات صحية بدون تمايز يمكن اكتشافه.
      ملاحظه: ستشكل hPSCs الصحية مستعمرات ضيقة الحواف مع خلايا لها نواة كبيرة وسيتوبلازم صغير جدا ونواة بارزة. سوف تظهر مستعمرات iPSC المتمايزة اختلافات مورفولوجية واضحة لتلك الخاصة بمستعمرات hPSC الموصوفة أعلاه, لا سيما حول الحواف الخارجية للمستعمرات أو في المركز.
   5. أضف الكواشف المدرجة في الجدول 1 لتكوين وسط N2 المطلوب للتمايز. أحضر هذه الوسيلة إلى RT قبل الاستخدام.
   6. بمجرد الوصول إلى RT، قم بشفط وسط زراعة الخلايا الخالي من المصل من كل بئر من الصفيحة المكونة من 6 آبار واستبدله ب 2 مل من وسط N2 مضاف برفق بماصة مصلية سعة 5 مل.
   7. أضف مثبطات الشلل العشري (SMAD) المثبطات ، SB-431542 (10 ميكرومتر) و LDN 193189 (100 نانومتر).
      ملاحظه: يمكن إضافة مثبطات SMAD إلى وسط N2 بعد وضع الوسط في كل بئر أو إلى الكمية المطلوبة من وسط N2 قبل استبدال وسط زراعة الخلايا الخالي من المصل. يمكن دمج المثبطات بالتساوي في الوسط عن طريق تدوير اللوحة برفق أو قلب الأنبوب الذي يحتوي على الوسط والمثبطات 3-4 مرات.
   8. أضف وسائط N2 الطازجة المكملة ب SB-431542 (10 ميكرومتر) و LDN 193189 (100 نانومتر) يوميا لكل بئر لمدة يومين.
      ملاحظه: يضاف وسط N2 الطازج لتقليل التعرض المطول للخلايا لثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) الذي يستخدم لإذابة مركبات SB-431542 و LDN 193189 ومنع السمية الخلوية.
2. توليد كرويات الأديم العصبي ثلاثي الأبعاد من مستعمرات الأديم العصبي الظاهر المستحثة (الأيام من 3 إلى 7)
   1. ارفع مستعمرات الأديم العصبي الظاهر المستحثة باستخدام التباين باتباع الخطوات 1.2.2-1.2.8.
   2. أولا ، قم بإزالة 2 مل من وسط N2 من اللوحة المكونة من 6 آبار ، واغسل 1x باستخدام HBSS لضمان إزالة كل وسيط N2.
      ملاحظه: يمكن أن يتداخل وسط N2 مع نشاط الإنزيم المنفصل ، مما يمنع الانفصال الكافي لمستعمرات الأديم العصبي الظاهر عن البئر.
   3. أضف 1 مل من 2.4 وحدة / مل إلى كل بئر يحتوي على مستعمرة.
   4. احتضان البئر لمدة 20-25 دقيقة (30 دقيقة كحد أقصى) عند 37 درجة مئوية. تحقق من انفصال المستعمرة بانتظام.
      ملاحظه: قد تنفصل المستعمرات الصغيرة في غضون 20 دقيقة. يجب تجاهل أي مستعمرات تظل عالقة بعد 30 دقيقة.
   5. بعد الحضانة ، أضف 1 مل من وسط N2 إلى البئر لإيقاف نشاط الإنزيم المتباين ونقل المستعمرات إلى أنبوب سعة 15 مل باستخدام طرف ماصة P1000 عريض التجويف أو طرف ماصة P1000 معدل مقطوع بمقص معقم (مما يجعله طرفا عريض التجويف P1000).
   6. اسمح لتكتل المستعمرة بالغرق في قاع الأنبوب بجاذبية.
      ملاحظه: ستستغرق هذه العملية حوالي 1 دقيقة.
   7. بمجرد غرق الكتل، قم بإزالة المادة الطافية بعناية بطرف ماصة P1000 قياسي واستبدلها ب 1 مل من وسط N2 الطازج. كرر خطوة الغسيل هذه ثلاث مرات لضمان الإزالة الكاملة للتباعد.
      ملاحظه: أي تباين متبقي سيمنع التكوين المنتظم للأديم الظاهري العصبي ويؤدي إلى موت الخلايا.
   8. بعد الغسيل ، أعد تعليق كتل الخلايا في 3 مل من وسط N2 ، وانقلها إلى بئر واحد من صفيحة مكونة من 6 آبار ، وأضف 40 نانوغرام / مل من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF).
      ملاحظه: إذا تم فصل عدد كبير من مستعمرات الأديم العصبي الظاهر ، فيمكن طلاء هذه المستعمرات عبر بئرين أو أكثر من صفيحة مكونة من 6 آبار لمنع اندماج الكرويات. بعد 24 ساعة من انفصال المستعمرات ، تحقق مما إذا كانت الكرات قد تشكلت.
   9. حافظ على الكرات في نفس الوسائط لمدة 3-4 أيام القادمة ولكن أضف bFGF طازجا (40 نانوغرام / مل) إلى كل بئر يوميا لتعزيز تكاثر خلايا الأديم العصبي ، والتنظيم الذاتي ، والحث على الظهارة العصبية وتوسيعها.
      ملاحظه: إذا تم طلاء الكرويات بكثافة أعلى ، فمن المحتمل أن تتحول الوسائط إلى اللون الأصفر وتتطلب استبدالها كل يومين ب bFGF طازج (40 نانوغرام / مل). ومع ذلك ، لا ينصح بذلك ، وبدلا من ذلك ، يجب الحفاظ على عدد أقل من الكرويات في كل بئر لتجنب هذه المشكلة. يمكن تضمين الكرات الكروية في مصفوفة الغشاء القاعدي بعد 3 أيام إذا كانت الظهارة العصبية واضحة. إذا لم تكن الظهارة العصبية واضحة أو لا تبدو قوية ، فاحتفظ بالظهارة الكروية ليوم آخر وتحقق مرة أخرى.

< p class = "jove_content" > الجدول 1: N2 متوسط. يسرد الجدول الكواشف المطلوبة لإعداد وسط N2.

مكونات الوسائط تركيز DMEM مزيج المغذيات F12 10x 500 مل (DMEM / F-12) مكمل N2 5 مل (100x) تم توفيرها بنسبة 1٪ ب 27 مكمل غذائي 10 مل مكمل بنسبة 2٪ محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100x) مكمل بنسبة 1٪ البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) مكمل بنسبة 1٪ 2-ميركابتو إيثانول 50 مل (1000 ضعف) مكملة بنسبة 0.1٪

النتائج

الشكل 1: رسم تخطيطي لتوليد عضيات الدماغ القشرية القابلة للتكرار. سير العمل التخطيطي للإجراء التجريبي لتوليد عضيات الدماغ القشرية من hPSCs المحفوظة في الوسط الخالي من التغذية. يوفر سير العمل نظرة عامة على ست خطوات متضمنة في تمييز hPSCs ثنائية الأبعاد إلى أنسجة بشرية صفيحة قشرية منقوشة ثلاثية الأبعاد في العضيات.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 16٪ فورمالديهايد (W / V) خال من الميثانول ثيرمو فيشر العلمي هاتف 28908 يتم تخفيف 4٪ من PFA في 1x PBS 2-ميركابتو إيثانول 50 مل (1000 ضعف) لايف تكنولوجيز أستراليا (TFS) 21985023 تستخدم في وسائط NM و DM ب 27 مكمل غذائي 10 مل لايف تكنولوجيز أستراليا (TFS) 17504044 تستخدم في وسائط NM و DM مجهر CKX53 مع كاميرا SC50 أوليمبوس لوحات زراعة خلايا الآبار Corning Costar 6 سيجما ألدريتش بي تي واي المحدودة CLS3516-50EA مسحوق Dispase II ثيرمو فيشر العلمي 17105041 يذوب المسحوق في HBSS ، ويتم ترشيحه من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر ، ويتم تخزينه عند 10 مل وتخزينه عند -20 درجة مئوية DMEM مزيج المغذيات F12 10x 500 مل (DMEM / F-12) ثيرموفيشر 11320082 تستخدم في وسائط NM و DM DMSO ثنائي ميثيل سلفوكسيد سيجما ألدريتش بي تي واي المحدودة D2650-100 مل محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco سيجما ألدريتش بي تي واي المحدودة D1408-500 مل مصفوفة Falcon Matrigel hESC المؤهلة في المختبر تكنولوجيز بي تي واي المحدودة FAL354277 قم بعمل كميات كبيرة من 100 ميكرولتر وتخزينها عند -20 درجة مئوية مكمل GlutaMAX 100x ثيرمو فيشر العلمي 35050061 تستخدم في وسائط NM و DM محلول الملح المتوازن هانكس سيجما ألدريتش بي تي واي المحدودة H8264 الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (EU79) مخطط داخلي من الخلايا الليفية الجلدية الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (G22) خلايا جينيا الحيوية تم الحصول عليها من Genea Biocells (سان دييغو ، الولايات المتحدة) الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (WTC) هدية من البروفيسور بروس كونكلين InSolution TGF-Β RI Kinase Inhibitor VI ، SB431542 ميرك US1616464-5 ملغ محلول الأنسولين المؤتلف البشري سيجما ألدريتش بي تي واي المحدودة I9278 تستخدم في وسائط NM و DM LDN193189 ثنائي هيدروكلوريد سيجما ألدريتش بي تي واي المحدودة SML0559-5 ملغ تستخدم أثناء التمايز محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100x) ثيرمو فيشر العلمي 11140050 تستخدم في وسائط NM و DM mTeSR Plus تقنيات الخلايا الجذعية 100-0276 تستخدم للحفاظ على مستعمرات hiPSC قبل التمايز باستخدام وسائط NM مكمل N2 5 مل (100x) لايف تكنولوجيز أستراليا بي تي واي المحدودة 17502048 تستخدم في وسائط NM و DM البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) ثيرمو فيشر العلمي 15140122 تستخدم في وسائط NM و DM FGF البشري المؤتلف الأساسي أنظمة البحث والتطوير 233-FB-01M يتم إجراء الحصص عند 20 ميكروغرام / مل وتخزينها عند -20 درجة مئوية SB431542 توكرس 1614 تستخدم أثناء التمايز ألواح متعددة الآبار منخفضة للغاية ، لوح 24 بئرا ، بوليسترين سيجما ألدريتش بي تي واي المحدودة CLS3473-24 إيه